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细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒(柱式吸附)
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细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒(柱式吸附)公司正在出售的产品:0.156-10 ng/mL 人肾损伤分子1(Kim-1)ELISA试剂盒 31.2-2000 pg/mL ELISA Kit for Human Succinate-semialdehyde dehydrogenase, mitochondrial 31.2-2000 pg/mL 人催乳素诱导蛋白(PIP)ELISA试剂盒 1
  细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒(柱式吸附)的详细资料:

实验要点及说明:

1.本方法适用于贴壁细胞培养,而不适用于悬浮细胞培养,悬浮细胞可使用滴片法;

2.所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造,并经过铬酸洗液处理;

3.盖玻片非常薄,易碎,取放盖玻片时动作要轻;

4.如果需要更多生长状态一致的细胞,可以使用较大的培养皿,但不宜过大,以避免培养液的浪费和增加污染机率;

5.如果细胞贴壁生长能力较差,可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

操作要点:

1)将培养基在37℃水浴锅预热;准备一个15mL无菌的离心管,加入8mL预热培养基。

2)将冻存细胞从液氮罐中取出,快速放入37℃水浴锅中复温(可准备一洁净的烧杯,装满37℃的水,细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内,再逐步转移到水浴锅中)。轻轻晃动冻存管,使细胞能在1~2min内完全解冻,使细胞能尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。注意冻存管管口不能没入水中,BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。

3)用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内,将管内细胞转移至准备好的离心管内,轻轻吹打液体,使细胞均匀分散,降低DMSO浓度,吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次,均转移至离心管内。

4)800rpm离心5min,弃上清,加入新鲜的培养基,吹打制成细胞悬液。

5)将细胞悬液转移至T25细胞瓶内,补加适量的培养基,轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀,放入温箱内培养。

6)第二天观察细胞贴壁生长情况,换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养,待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代,细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

产品参数:

中文名称

英文名称

产品规格

产品货号

细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒(柱式吸附)

DNA Ladder Extraction Kit with Spin Column

50次

BJ-01X6324

商品详细介绍:

本试剂盒是目前先进的DNA Ladder抽提试剂盒之一。本试剂盒是针对细胞凋亡过程中产生的核小体间DNA链断裂而设计的。可以非常有效地抽提小片段为180-200bp的DNA ladder,同时又可以抽提到大50kb左右的基因组DNA。本试剂盒可以抽提50个样品。

DNA ladder也称DNA fragmentation,是细胞凋亡的一个重要指标。通常观察到DNA ladder,就可以判定细胞发生了凋亡。

样品首先被蛋白酶K消化,随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液,然后加入到纯化柱内。通过高速离心,使DNA在穿过纯化柱的瞬间,结合到纯化柱上,随后通过两次洗涤去除各种杂质,后通过洗脱液把DNA洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提,无需酒精沉淀,样品裂解后仅需约15分钟即可完成。

通过DNA纯化柱方式抽提DNA ladder比用传统的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷,小片段DNA不容易损失。试剂盒提供了RNase A,可以获得不含RNA的高纯度总DNA,排除了RNA对DNA ladder观察造成的干扰。

本试剂盒每次多可以抽提20mg组织或200-350万个培养细胞。样品用量过多,反而会影响抽提效果。纯化柱对于DNA的大容量约为30微克。通常每200万Hela细胞或500万淋巴细胞可以抽提得到15-25微克总DNA,每25mg肝、脑、肾组织可以抽提得到10-30微克总DNA,每25毫克心、肺组织可以抽提得到5-10微克总DNA,每10mg脾组织可以抽提得到5-30微克总DNA。样品的用量请勿超过纯化柱的容量,样品用量好能保持在纯化柱容量的70%或以下。当然过少的样品也不利于检测到DNA ladder。

对于培养细胞的凋亡检测,通常6孔板一个孔的细胞就足够用于DNA ladder的抽提和检测。

试剂盒组份:

样品裂解液A——————10ml

样品裂解液B——————11ml

洗涤液I——————21ml(第一次使用前加入7ml无水乙醇)

洗涤液II——————16ml (第一次使用前加入24ml无水乙醇)

洗脱液——————22ml

蛋白酶K——————1.1ml

RNase A——————220μl

DNA纯化柱及废液收集管——————50套

储存条件:室温,有效期一年。( 蛋白酶K需-20℃保存)

实验报告:

一、分离与培养:

1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将组织剪成1mm3左右大小;

2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置;

3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化;

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;

5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;

二、免疫荧光鉴定:

1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min;

2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;

3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗,然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;

5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗, 37℃条件下放置1h;

6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

培养操作步骤

1.用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出,用无菌丝绸布擦拭干净,不要用纱布;

2.将盖玻片轻轻放入6孔培养板(每孔一片)或培养皿中(每个平皿可放置2-3片);

3.在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时;

4.将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中,使盖玻片完全浸在培养液中;

5.将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天,当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时,将培养板取出,用盖片镊轻轻取出盖玻片,用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。 
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