产品参数:
中文名称 | 英文名称 | 产品规格 | 产品货号 | MTT检测试剂盒 | MTT Assay Kit | 500次 | BJ-01X6322 |
MTT广泛用于检测细胞生长,其原理是MTT可以被活细胞线粒体内的脱氢酶还原生成深紫色的formazan结晶,而死细胞则无此活性。深紫色的formazan结晶被溶解后可以通过测定490nm波长的光吸收而测定出其浓度,并由此推测出细胞的活力,细胞增殖越旺盛,则吸光度越高;细胞毒性越大,则吸光度越低。 商品详细介绍: 产品特点: 1.采用*的Formazan溶解液,可以充分溶解formazan,减少误差。 2.背景低,灵敏度高,线性范围宽,重复性好。 3.本产品为足够500次(5个96孔细胞培养板)微孔板检测。 4.可用于生物活性因子活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定等。 储存条件:低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存),有效期一年。 使用方法: 下面操作是检测细胞毒性的试验,其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验),操作步骤可以以此为基础稍作修改即可,故不再赘述。 ㈠、接种细胞 1.按常规消化法消化汇合的单层细胞,收集到含血清的培养基中。 2.200g离心5分钟收集细胞沉淀。 3.用培养基重悬细胞沉淀,制备成单细胞悬浮液并计数。 4.将细胞稀释到2.5×103个/mL~5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定),如果不知道生长数度,一般可以稀释到1×10个/mL。 5.将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。 6.用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞,则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。注意:一定要把细胞加在孔的正中,否则细胞会聚集在孔的角落处,影响试验。 7.用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零),第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11 列反应的影响。 8.按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天,使细胞进入指数生长期。 ㈡、药物处理 9.用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度,则需要预试验确定),一般一种药物需要做3块平行板。 10.去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞),保留第1 列和第12列各孔中的培养基。 11.在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基,这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。 12.在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物,每列加入一个浓度的药物。 13.按常规方法把96孔板继续放在在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间,此段时间即为药物处理细胞的时间,由用户自己决定。 14.处理结束后去除第2 到第11列(共10列,均含细胞)所有孔中的培养基,并再加入100μL新鲜培养基。 15.每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。 ㈢、存活细胞计数 16.在生长末期,去除第1到第11列各孔中的培养基后,再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分),用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。注意:溶液A在低温情况下会凝固,使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解,摇匀后使用。MTT有致癌性,一定要带手套操作。 17.小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收,最好尽可能去除。 18.每孔加入100μL溶液B,置摇床上低速振荡10分钟,使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。 19.由于产物不稳定,故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。 注意:用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。 20.计数同样处理的各次重复的平均值。 21.以药物浓度为横轴,以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度绝对值差别很大,一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为100%),这样便于计算出IC50,用于各种药物处理效果的比较。注意:如果测生长曲线,则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型,具有促进作用的则斜率加大。 |
实验报告: 一、分离与培养: 1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将组织剪成1mm3左右大小; 2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置; 3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织*被消化; 4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养; 5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养; 二、免疫荧光鉴定: 1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min; 2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min; 3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min; 4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗,然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜; 5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗, 37℃条件下放置1h; 6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。 培养操作步骤 : 1.用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出,用无菌丝绸布擦拭干净,不要用纱布; 2.将盖玻片轻轻放入6孔培养板(每孔一片)或培养皿中(每个平皿可放置2-3片); 3.在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时; 4.将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中,使盖玻片*浸在培养液中; 5.将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天,当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时,将培养板取出,用盖片镊轻轻取出盖玻片,用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。
实验要点及说明:
1.本方法适用于贴壁细胞培养,而不适用于悬浮细胞培养,悬浮细胞可使用滴片法; 2.所使用的盖玻片应该为优质玻璃,并经过铬酸洗液处理; 3.盖玻片非常薄,易碎,取放盖玻片时动作要轻; 4.如果需要更多生长状态一致的细胞,可以使用较大的培养皿,但不宜过大,以避免培养液的浪费和增加污染机率; 5.如果细胞贴壁生长能力较差,可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。 操作要点: 1)将培养基在37℃水浴锅预热;准备一个15mL无菌的离心管,加入8mL预热培养基。 2)将冻存细胞从液氮罐中取出,快速放入37℃水浴锅中复温(可准备一洁净的烧杯,装满37℃的水,细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内,再逐步转移到水浴锅中)。轻轻晃动冻存管,使细胞能在1~2min内*解冻,使细胞能尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。注意冻存管管口不能没入水中,BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。 3)用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内,将管内细胞转移至准备好的离心管内,轻轻吹打液体,使细胞均匀分散,降低DMSO浓度,吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次,均转移至离心管内。 4)800rpm离心5min,弃上清,加入新鲜的培养基,吹打制成细胞悬液。 5)将细胞悬液转移至T25细胞瓶内,补加适量的培养基,轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀,放入温箱内培养。 6)第二天观察细胞贴壁生长情况,换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养,待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代,细胞活力恢复后才能进行后续的实验。 血管紧张素1转换酶抑制剂抗体 拮抗凋亡转录因子抗体 α-1抗胰 ATP结合蛋白家族6抗体 三磷酸腺苷结合盒亚家族G1抗体 脂联素受体2抗体 ANGEL1蛋白抗体 ANGEL2蛋白抗体 ANKLE2蛋白抗体 睾丸特异性锚样蛋白1抗体 锚蛋白重复结构域蛋白13B抗体 锚蛋白重复结构域蛋白20A1抗体 锚蛋白重复结构域蛋白20A3抗体 锚蛋白重复结构域蛋白22抗体 锚蛋白重复结构域蛋白50抗体 BC-020(人乳腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2 BC-021(人乳腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2 BC-022(人乳腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2 BE(2)-M17(人神经母细胞瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 BGC-803(人胃癌细胞) 5×106cells/瓶×2 C918(人眼脉络黑色素瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 CAL-27(人舌鳞癌细胞) 5×106cells/瓶×2 LS 180(人结肠腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2 CNE-2Z(人鼻咽癌细胞) 5×106cells/瓶×2 MTT检测试剂盒COLO 201(人结直肠腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2 CW-2(人结肠癌细胞) 5×106cells/瓶×2 CRT(人神经胶质瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 D283 Med(人脑髓母细胞瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 EA.hy926(人脐静脉细胞融合细胞) 5×106cells/瓶×2 ECV-304(人脐静脉内皮细胞) 5×106cells/瓶×2 EJ(人膀胱癌细胞) 5×106cells/瓶×2 H-97(人高转移肝癌细胞) 5×106cells/瓶×2 |