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酵母RNA的分离和鉴定
点击次数:344 更新时间:2016-06-07

    ELISA试剂盒由于RNA的来源和种类很多,因此提取方法各异,一般有苯酚法、去污剂法、和盐酸胍法。其中苯酚法是实验室zui常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中。DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出,此法能较好地除去DNA及蛋白质,提取的RNA具有生物活性。

  工业上制备RNA多选用成本低,适于大规模操作的稀碱法及浓盐酸。用发酵工业的下脚料如酵母、白地酶如青霉菌菌丝体登提取RNA,其得率常为菌种重量的3%~5%。而DNA含量仅为0.03%~0.52%,因此提取RNA多以酵母为原料。稀碱法是用氢氧化钠溶液,使细菌细胞壁变性,浓盐法是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。用稀碱法使酵母细胞裂解后,用酸中和,然后除去菌体,使乙醇沉淀上清液中的RNA或将pH值调至RNA的等电点,是蛋白质沉淀出来。

  RNA是生物高分子化合物,进一步水解可生成磷酸、戊糖和碱基。各种组分可用于下述方法鉴定:   1.磷酸于钼酸铵试剂作用能产生黄色的磷钼酸铵沉淀。

  2.核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。

  3.嘌呤碱与硝酸银产生白色的嘌呤银化合物沉淀。

实验方法

  1.酵母RNA提取:

  (1)称4g干酵母粉置于100ml烧杯中,加入40ml0.2%氢氧化钠溶液,沸水浴上加热30分钟,不断搅拌。

  (2)加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性,4000r/min,离心10~15分钟。

  (3)取上清液,加入30ml 95%乙醇洗2次,每次用10ml。

  (4)用无水洗两次,每次10ml,洗涤时可用小玻棒小心搅动沉淀。

  (5)用布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。

  (6)称量所得RNA样品重量,计算得率。

  2.RNA组分鉴定:

  (1)水解RNA:像锥形瓶中加入少量(0.1~0.2g)酵母RNA个10%硫酸溶液15ml,在瓶口上插一玻璃小漏斗,漏斗上盖上表面皿,然后在沸水浴中加热水解约30分钟,过滤,取滤液进行下列实验。

  (2)嘌呤碱基的检查:取试管一支,加入1ml 0.1mol/L硝酸银溶液,再逐滴加1mol/L氨水至沉淀消失。然后加入1ml滤液,放置片刻,观察有无嘌呤碱基的银化合物沉淀产生。

  (3)磷酸的检查:取2ml滤液放入1支试管中,加入5滴硝酸银和1ml钼酸铵溶液后,在沸水中加热,观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。

  (4)戊糖的检查:取一支试管,加入1ml滤液,然后加入2ml地衣酚试剂,摇匀后在沸水浴上加热10~15分钟,观察颜色的变化。  

注意事项

  1.稀碱法提取的RNA为变性RNA,可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备,不能作为RNA生物活性实验材料。

2.脱氧核糖及核糖均可与地衣酚反应。因此地衣酚试验不能作为RNA与DNA鉴定的依据。

ELISA试剂盒

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