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PCR反应条件把控
点击次数:64 更新时间:2024-06-03

         PCR 反应体系由反应缓冲液(10×PCR Buffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、

耐热 DNA 聚合酶(Taq 酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1Primer2)、靶序列(DNA 模板)

五部分组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。PCR反应需要一定的条件才能完成,这些条件主要有以下方面:

一、缓冲液

任何一个生化反应都必须在一定的缓冲体系中进行,缓冲体系除了提供一定的pH缓冲能力外,还有一些有助于反应进行的成分。PCR反应缓冲液通常采用10 mmol/L Tris-HClpH 8.3-9.0,室温)缓冲液体系,其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二价阳离子,一般采用Mg2+,以MgCl2的形式提供,Mg2+的浓度高低可显著影响 PCR扩增产物的特异性,此外,缓冲液中还含有50 mmol/LK+,有利于引物与模板的退火。有些缓冲液中还加入明胶或血清白蛋白(100 μg/mL)及去污剂(如Twcen20 等),对Taq DNA聚合酶起稳定作用。

二、模板

PCR模板是含有待扩增序列的 DNAmRNAcDNA等,模板数量可直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR扩增,104107个模板分子可达到满意的效果,一般宜用纳克(ng)级的克隆DNA、微克(μg)水平的染色体DNA102105拷贝待扩增的DNA片段作为起始材料。除了数量外,模板的质量也非常重要,不能有太多的蛋白质和其他污染,特别是其他DNA的污染,即使是痕量的DNA,也会导致非特异性产物。

三、dNTP

dNTPdATPdTTPdGTPdCTP的总称。贮备液为pH 7.0 左右,其浓度一般为20 mmol-20℃保存。体系中为20~200 μmol即可,过低则反应速度下降,浓度过高则特异性下降,因为dNTP能络合溶液中的Mg2+,产生错配或抑制Taq DNA聚合酶活性。

四、耐热的DNA聚合酶

PCR反应中使用的 DNA聚合酶必须耐高温,在90℃以上的高温下仍能有活性,正是由于耐热DNA聚合酶的应用才使 PCR技术得以实现,目前使用的耐高温DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。

五、引物

PCR反应的最佳条件

根据大量的研究报道,PCR反应的最佳条件为:①Taq DNA聚合酶的浓度为1.0-2.5 U/100μL反应液;②dNTP的浓度为20200 μmol/L;③Mg2+浓度为0.52.5 mmol/L;④引物的浓度为0.21.0 μmol/L。在准备具体的PCR反应时,还要针对模板特性、PCR仪等进行上述反应体系的优化,并设置试验确定连退火温度、延伸时间,建立其相应的PCR反应优程序。


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