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普通pcr和荧光定量pcr引物设计比较
点击次数:107 更新时间:2024-05-17

普通pcr和荧光定量pcr引物设计比较:

一、方法不同

1、普通pcr引物设计:引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

2、荧光定量pcr引物设计:通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,标记跟踪PCR产物进行实时监测反应,利用与之相适应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度 


二、原理不同 

1、普通pcr引物设计:为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。

2、荧光定量pcr引物设计:在PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程,然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中,对全程PCR扩增过程进行实时检测,根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。

 

三、注意事项不同

1、普通pcr引物设计:引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度在15~30碱基之间。

1、荧光定量pcr引物设计:实时荧光定量 PCR 仪应安放在湿度较低、灰尘较少、远离水池的平稳台面上,不能有强光直射,室内应通风良好,无腐蚀性气体 。

假阳性是指出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

产生的原因有:

①引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行 PCR 扩增时,扩增出的 PCR 产物为非目的序列;

②靶序列太短或引物太短;

③靶序列或扩增产物的交叉污染。

解决方法有:操作轻柔,防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外造成污染;除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材高压消毒;离心管及加样枪头等一次性使用。必要时,可在加标本前,将反应管和试剂用紫外光照射,以破坏存在的核酸。


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