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RT-PCR实验反应体系灵敏度优化方法
点击次数:76 更新时间:2024-06-24

RT-PCR实验反应体系灵敏度优化方法

1. 分离高质量RNA

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTASDSRNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl0.2M4倍体积的乙醇,室温放置3-5分钟,10,000×g离心5分钟。

2. 使用无RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶:

在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中,在缓冲液和还原剂(DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解RNARNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase ABCRNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase

逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链,并降解RNADNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。

SuperScriptⅡ逆转录酶,RNaseH- MMLV逆转录酶及thermoScript逆转录酶,RNaseH- AMV,比MMLVAMV得到更多量和更多全长的cDNART-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScriptAMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力,尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比,SuperScripⅡ显著提高了长 RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性,所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。在建议的合成条件下,使用oligo(dT)引物和10μCi[α-P]dCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。

3. 提高逆转录保温温度:

较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,增加了反应的产量。对于多数RNA模板,在没有缓冲液或盐的条件下,将RNA和引物在65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消除大多数二级结构,从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构,即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript逆转录酶,并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性,尤其是当使用基因特异性引物(GSP)进行cDNA合成时(见第三章)。如果使用GSP,确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外,还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度,并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cDNA热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化 RT-PCR所需的多种温度切换。

Tth热稳定聚合酶在Mg2+存在条件下作为DNA聚合酶,在Mn2+存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而,PCR过程中Mn2+的存在会降低忠实性,这使得Tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增,如cDNA的克隆。另外,Tth的逆转录效率较低,这会降低灵敏度,而且,既然单个酶就可以进行逆转录和PCR,那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。

4. 促进逆转录的添加剂:

包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中,可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构,最多可以加入20%的甘油或10%DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度,可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中,那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%,这不足以抑制PCR

5. RNaseH处理:

PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板,据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合,在这种情况下,RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时,RNaseH处理是必需的,比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板,RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应,RNaseH处理是可选的,因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNADNA复合物中的RNA水解掉。

6. 小量RNA检测方法的提高:

当仅有小量RNA时,RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的,可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品,无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml

在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度,而且对于小量RNA,减少SuperScriptⅡ的量并加入40单位的 RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元,仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入 BSARNase抑制剂。


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