细胞培养操作规程： 一．培养基及培养冻存条件准备： 1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。 2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。 3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。 二． 细胞处理： 1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。 2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 中文名称：细胞增殖示踪荧光探针 英文名称：CFDA, SE 产品规格：25mg 产品货号：BJ-01X6439 CFDA, SE，英文全称Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞示踪染料，不仅可用于细胞增殖的体外实验，还可用于追踪细胞在体内的分裂增殖过程。 CFDA, SE是二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）的衍生物，具细胞膜渗透性，本身不具有荧光发光性。当通过被动运输穿透细胞膜进入活细胞后，可被胞浆内的酯酶催化生成羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），可发强烈的绿色荧光，不能穿透细胞膜，能完好的保留在胞内。CFSE还可自发性并不可逆地与细胞内的氨基结合从而偶联到细胞蛋白质上，同时过量且未被偶联的CFDA, SE通过被动扩散回到细胞外培养基内，被后续清洗步骤所清除。经CFDA, SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数月，因此非常适用于细胞群落分析。 CFDA, SE标记细胞的荧光非常均一，优于以前使用的其他细胞示踪荧光探针如PKH26，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均一。在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的一半，通过流式细胞仪（FL1通道）根据荧光强度的不同，可检测出未分裂细胞，分裂一次（1/2的荧光强度），二次（1/4的荧光强度），三次（1/8的荧光强度），以及更多分裂次数的细胞。CFSA，SE可检测分裂次数多达八次甚至更多。经CFDA, SE标记的细胞可用于体外和体内增殖研究，且具有不会使邻近细胞染色的功能。CFDA, SE常用于淋巴细胞的增殖检测，也可用于成纤维细胞，自然杀伤细胞，造血祖细胞等其他细胞的增殖检测。 CFDA, SE标记细胞呈绿色荧光，Ex=494nm，Em=521nm，除了流式细胞仪检测细胞增殖外，还可用荧光酶标板定量活细胞数目，或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。本品以粉末形式提供，需用DMSO制备储存液后再使用。 |
细胞培养方法： 1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代 ①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化； ③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止； ④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清； ⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基； ⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。 2、细胞复苏： ①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。 ②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。 3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种 ①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化； ③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞； ④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。 操作规程 1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时. 2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。 3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。 4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。 7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。 8、结果分析 a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90) Fructus arctii牛蒡子LAMP鉴定试剂盒 中药材鉴定试剂盒/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-4周 Goose Parvovirus(GPV)鹅细小病毒探针法荧光定量PCR试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Semen strychni马钱子LAMP鉴定试剂盒 中药材鉴定试剂盒/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-4周 Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)口蹄疫病毒通用RT-LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 1-2周 Porcine Enterovirus(PEV)猪肠病毒RT-LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Fructus psoraleae补骨脂PCR鉴定试剂盒 中药材鉴定试剂盒/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-4周 Capripox Virus羊痘病毒LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Rhizoma gastrodiae天麻LAMP鉴定试剂盒 中药材鉴定试剂盒/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-4周 Volepox Virus田鼠痘病毒LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Trichothecium spp.单端孢霉属通用探针法荧光定量PCR试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 鹿源性成分染料法荧光定量PCR试剂盒 种源性检测/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 1-3天 Nematodirus abnormalis畸形*线虫探针法荧光定量PCR试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 细胞增殖示踪荧光探针细亚硝酸盐还原总活性比色法定量检测试剂盒 20次 细胞氯乙酰转移（CAT）活性荧光定量检测试剂盒 20 蛋白免疫杂交封闭溶液 100毫升 活体细胞半胱蛋白-10（CASPASE-10）活性原位荧光染色检测试剂盒 20次 （SCHMORL）染色试剂盒 琼脂培养基K(XLD琼脂) 英文名称：Agar Medium K(Xylose,Lysine,Dexycholate Agar) 产品规格：250g 布氏琼脂 英文名称：Brucella Agar 产品规格：250g 抗生素检测培养基II 英文名称：Antibiotic Agar No.2 产品规格：250g 总RNA样品mRNA选择纯化试剂盒 10次 淀粉-双岐杆菌鉴定 英文名称： 产品规格：20支 真/酵母细胞线粒体分离（粗提）试剂盒 10次
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