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CFSE/PI双染细胞毒性检测试剂盒
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CFSE/PI双染细胞毒性检测试剂盒公司正在出售的产品:15.6-1000 pg/mL ELISA Kit for Human Apolipoprotein A-IV 0.156-10 ng/ml 人过氧化还原2(PRDX2)ELISA试剂盒 0.156-10 ng/mL 人HMG盒蛋白1(HBP1)ELISA试剂盒 0.156-10 ng/mL 人组织非特异性碱性(AP-TNAP)ELISA试剂
  CFSE/PI双染细胞毒性检测试剂盒的详细资料:

中文名称:CFSE/PI双染细胞毒性检测试剂盒

英文名称:

产品规格:500T

产品货号:BJ-01X6513

CFSE/PI 双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料CFSE(CFDA-SE)和PI对细胞进行染色,利用CFSE标记靶细胞,PI标记死的靶细胞来区分不同的细胞,活的靶细胞成绿色,死的靶细胞成红色和绿色,从而检测细胞毒性作用。根据不同的实验方案设计,可以用来检测化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性T 细胞或NK 细胞介导的细胞毒作用。

CFDA-SE 是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料,可以标记活体细胞。CFDASE是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料,可以结合细胞内的蛋白质。CFDASE在结构上将酚羟基部位改造成AM体,所以自身不发荧光,荧光背景低,脂溶性高,能够轻易穿透细胞膜,进入细胞内的CFDASE的AM 部位能被细胞内酯酶水解生成CFSE,通过共价结合赖侧链的氨基而掺入细胞内和细胞表面的蛋白,且结合后发出强的绿色荧光。CFSE的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合,固定在细胞内,不会漏出细胞外。CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核,在细胞核的荧光强。

CFSE毒性小,不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单,且不用放射性同位素,不存在安全隐患。可以更快速,更准确和更安全地得到想要的实验数据。

CFSE/PI标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞毒性检测。

CFSE标记细胞呈绿色荧光,荧光波长:λex=496 nm,λem=516 nm。流式检测时的激发波长可以选择488nm,此时的发射波长为516nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。PI标记细胞呈红色荧光,流式检测时的激发波长可以选择488nm,此时的发射波长为647nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL2 detection channel。

CFSE标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞毒性外,还可单染后用于细胞增殖检测,或者用荧光酶标板定量活细胞数目,或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。

储存条件:CFSE探针-20℃避光保存;溶解液-20℃保存;PI染色液2-8℃避光保存。

有效期:六个月。

细胞培养操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备F-12K培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 细胞处理:

1) 复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。


QQ截图20220509112004.png

细胞培养方法:

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔,通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0~10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小时,使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度(如无570nm 滤光片,可以使用560-600nm 的滤光片)。

8、结果分析

a、细胞的存活率:将各测试孔的OD 值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

 


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