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Caspase 8荧光法检测试剂盒(AFC)
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  Caspase 8荧光法检测试剂盒(AFC)的详细资料:

中文名称:Caspase 8荧光法检测试剂盒(AFC)

英文名称:Caspase-8 Fluorescence Metric Assay

产品规格:20T|50T|100T

产品货号:BJ-01X6373

本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织Caspase-8 检测。Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中Caspase-8 为关键的执行分子,与DNA 断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。Caspase-8 在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中,没有活性;但在细胞发生凋亡阶段,它被激活,活化的Caspase-8 由两个大亚基和两个小亚基组成,裂解相应的胞浆胞核底物,终导致细胞凋亡。Caspase-8 荧光检测试剂盒就是将Caspase-8 序列特异性的多肽偶联至发色基团。当底物被Caspase-8 剪切后,发色基团即游离出来,可通过荧光酶标仪测定其荧光强度(激发波长=485nm,发射波长=535nm)。

注意事项

1. Caspase-8 Substrate 避光保存及使用。

2. 对某些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡可能存在非依赖于Caspase-8 活化的机制,这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-8 活性无明显改变,需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。

3. 细胞数量需达到3~5×106 个或新鲜组织50~100mg,以便能达到测定需要的100~200μg 蛋白的要求,因为Caspase-8 的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关,如测定的RFU 值偏低,可以通过适当延长反应的时间,如果值还是不高,可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

细胞培养操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备F-12K培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 细胞处理:

1) 复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。


QQ截图20220509112004.png

细胞培养方法:

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔,通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0~10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小时,使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度(如无570nm 滤光片,可以使用560-600nm 的滤光片)。

8、结果分析

a、细胞的存活率:将各测试孔的OD 值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

产品相关关键字: Caspase 8 荧光法 检测试剂盒
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