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Ad-GFP-LC3B
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Ad-GFP-LC3B公司正在出售的产品:0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human RPE-spondin 15.6-1000 pg/mL ELISA Kit for Human Interleukin-17B 31.2-2000 pg/mL ELISA Kit for Human Probetacellulin 31.2-2000 pg/mL 人斯钙素2(STC-2)
  Ad-GFP-LC3B的详细资料:

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔,通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0~10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小时,使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度(如无570nm 滤光片,可以使用560-600nm 的滤光片)。

8、结果分析

a、细胞的存活率:将各测试孔的OD 值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

中文名称:Ad-GFP-LC3B

英文名称:Adenovirus expressing GFP-LC3B fusion protein

产品规格:1ml|10×1ml

产品货号:BJ-01X6347

本品是一种可以表达GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒,可以用于感染细胞或组织后进行细胞自噬(autophagy)的检测。

LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。LC3初被分析鉴定为microtubule-associated protein 1 light chain 3 。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亚家族,其中对于LC3B的研究为广泛。到目前为止,LC3B被认为是细胞自噬信号通路为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有125个氨基酸残基的蛋白,在蛋白合成后,被Atg4所酶切而失去了C端的22个氨基酸蛋白,从而暴露出C端的甘,人们把它命名为胞质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中,其C端暴露的甘经过一个类似泛素化的过程,以ATG7为E1样激活酶, 以ATG3为E2样连接酶,以Atg12-Atg5-Atg16复合物为E3样连接酶,在C端甘上共价连接上磷脂酰而成为LC3B-PE即LC3B II。与胞质定位的LC3B I不同,LC3B II定位于自噬体的内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后,自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切,而自噬体内膜上的LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解。尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大,但由于其强的疏水性,在SDS-PAGE电泳时,LC3B II比LC3B I迁移得更快,其表观分子量分别为14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染细胞后,在非自噬的情况下,荧光显微镜下GFP-LC3B以弥散的形式存在于细胞质中;而在自噬的情况下,荧光显微镜下GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上,以斑点的形式表现出来。

自噬是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关,在饥饿等不利的环境条件下, 细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分,为细胞的生存提供能量及原材料,促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用,自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。

Ad-GFP-LC3B是的重组腺病毒,感染后能够在靶细胞中有效表达绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白,呈现明亮的绿色荧光,可以用于细胞自噬的检测。

腺病毒感染细胞后为瞬时表达,通常不会与基因组DNA重组,不能用于筛选稳定细胞株。本产品感染体内外细胞后,有效表达时间通常不少于7天,不同细胞和组织的有效表达时间有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表达很可能会大大减弱。

Ad-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重组腺病毒载体系统,感染普通的细胞后不能进行扩增和重组,从而可以有效降低本产品在活体生物中的风险。

本产品可以在表达E1的HEK293A、HEK293等适当细胞中扩增。

本产品的滴度≥1×108 pfu/ml,使用时可以按照108pfu/ml进行计算。如果按照20 MOI感染6孔板的细胞,每孔50万细胞计算,共可以感染10个孔;如果按照20 MOI感染24孔板的细胞,每孔10万细胞计算,共可以感染50个孔。如果MOI值提高,则相应可以感染的孔数会减少;如果MOI值降低,则相应可以感染的孔数会增加。

储存条件:-20℃,有效期1~2个月。

细胞培养操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备F-12K培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 细胞处理:

1) 复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。


QQ截图20220509112004.png

细胞培养方法:

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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