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Ki67细胞增殖检测试剂盒(ICF/FACS法)
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Ki67细胞增殖检测试剂盒(ICF/FACS法)公司正在出售的产品:0.625-40 ng/mL ELISA Kit for Human Ryanodine receptor 2 0.156-10 ng/mL 人表皮生长因子样蛋白7 (EGF-like protein 7) ELISA试剂盒 78-5000 pg/mL ELISA Kit for Human Putative alpha-1-an
  Ki67细胞增殖检测试剂盒(ICF/FACS法)的详细资料:

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔,通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0~10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小时,使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度(如无570nm 滤光片,可以使用560-600nm 的滤光片)。

8、结果分析

a、细胞的存活率:将各测试孔的OD 值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

中文名称:Ki67细胞增殖检测试剂盒(ICF/FACS法)

英文名称:Ki67 cell proliferation Detection Kit

产品规格:20T

产品货号:BJ-01X6406

Ki67 蛋白是细胞周期相关的一种核蛋白,主要表达于细胞增殖分裂的各个时期(G1、S、G2 和M 期),但是在静息的细胞(G0 期)中不表达。Ki67 常用于检测肿瘤细胞的生长指数(免疫组化法利用计算细胞总数中的Ki67 阳性细胞数所占比例得到Ki67 指数)。

Ki67 通常通过标记抗Ki67 的抗体(FITC 绿色荧光)和DNA 染料碘化丙啶(PI,红色)而利用流式细胞仪检测来实现对细胞周期的检测。

操作方法

1. 在适的环境下培养细胞。

2. 除去培养液,用PBS 洗一次。

3. 处理和收集细胞,离心,(注意1)保证每管细胞数在106 个。

4. 用0.3 ml PBS 轻轻的重悬细胞, 然后慢慢加入0.7 ml 预冷的100%乙醇。用1 ml 玻璃移液管小心的混匀。在4°C 至少1h。(注意2)

5. 沉淀细胞,完全吸去上清。

6. 用150 μl PBS/1 % BSA 洗细胞2 次。

7. 用100μl 抗体孵育液(0.5% Tween-20/1%BSA/PBS)重悬细胞,加入1ul Ki67 抗体(1μg/106 cells),室温孵育1 小时。

8. 离心收集细胞,用150μl1% BSA-PBS 洗2 次。

9. 离心收集细胞,用50μl 抗体孵育液重悬,加1μl (1.5μg/106 cells) 羊抗鼠IgG-FITC,室温孵育30 分钟。离心收集细胞,150μl PBS/ 1 % BSA 洗2 次。

10. 用含有终浓度为10 μg/ml RNase A 和20μg/ml PI 的0.5 ml PBS(pH7.4)重悬细胞。

11. 避光使细胞在室温下孵育20min 后,离心收集细胞,150μl PBS/ 1 % BSA 洗2 次后,转移至流式检测管中重悬。

12. FACS 检测或者储存于4℃。

细胞培养操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备F-12K培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 细胞处理:

1) 复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。


2.png

细胞培养方法:

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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