细胞培养操作规程： 一．培养基及培养冻存条件准备： 1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。 2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。 3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。 二． 细胞处理： 1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。 2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 中文名称：台盼蓝染色法细胞活力检测试剂盒 英文名称：Typan Blue Staining Cell Viability Assay Kit 产品规格：100T 产品货号：BJ-01X6457 本试剂盒各组分均以无菌形式提供，可直接用于细胞实验。台盼蓝（Trypan Blue），一种偶氮、亲水性酸性蓝色染料，可透过死亡细胞和垂死细胞的细胞膜，将其染成蓝色，而活细胞由于其细胞膜的完整性，可将台盼蓝排斥在外，因此，通过颜色的变化即可将活细胞（活细胞呈透明无色）和死细胞鉴别开来，基于此原理，本品广泛用于细胞活性水平的常规评估。台盼蓝还可染色胶原和淀粉样蛋白。台盼蓝与蛋白结合形成的复合物可发出红色荧光。另外，台盼蓝（合适浓度）还常用来淬灭细胞表面的自荧光或者其他荧光信号。 使用方法 1）对于悬浮细胞，离心收集细胞，对其充分清洗后，加入适量细胞重悬液重悬细胞制成单细胞悬液；对于贴壁细胞，先用消化细胞，再按照悬浮细胞的方法制备单细胞悬液。 2）取0.1ml单细胞悬液，按照1:1比例与0.1ml 0.4%台盼蓝染色液充分混匀，室温染色3~10min。 【注】：因台盼蓝具有细胞毒性，染色时间过久会导致部分死细胞染色，干扰计数。通常染色3min即可。 3）取少量上述染色细胞加入血细胞计数板，于显微镜低倍镜下计数，分别计算着色细胞（即损伤细胞和死细胞）和总细胞。 【注1】：用移液枪加染色细胞时，沿着盖玻片的边缘轻轻加液使其*覆盖住整个小室。不可过量加液或者不足量。 【注2】：1mm2方格内细胞数通常控制在20-50 cells，当细胞数超过200个，需重新调整稀释倍数。 4）按照以下公式来计算细胞数目和活细胞百分比， a，计算每ml细胞数目：Cells/ml=1mm2大方格内的平均细胞数×稀释倍数×104；【注】：此时的稀释倍数为：步骤2所取的单细胞悬液与台盼蓝染色液混合后的稀释倍数 b，总细胞数目：Total cells=（Cells/ml）×初制备单细胞悬液的总体积 c，细胞活力值：Viability（%）=（总细胞数-总着色细胞数）/总细胞数×100 【注】：通常情况，健康的对数期培养细胞，活细胞至少占到95%。 储存条件：室温，有效期2年 |
细胞培养方法： 1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代 ①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化； ③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止； ④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清； ⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基； ⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。 2、细胞复苏： ①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。 ②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。 3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种 ①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化； ③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞； ④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。 操作规程 1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时. 2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。 3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。 4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。 7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。 8、结果分析 a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90) Canine Norovirus 犬诺瓦克病毒LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Bacillus coagulans凝结芽孢杆染料法荧光定量PCR试剂盒 种源性检测 50次 低温 负20度 一年 3-4周 Chikungunya Virus(CHIKV)基孔肯尼雅病毒RT-LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus(MERS-CoV)中东呼吸综合征探针法荧光定量RT-PCR试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Taenia solium链状带绦虫LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Aujeszky's Disease Virus(ADV)奥叶兹基氏病病毒LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Mink Enteritis Virus(MEV)水貂病毒性肠炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Mycobacterium malmoenes玛尔摩分枝杆探针法荧光定量PCR试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 鲨鱼源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒 定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-4周 Radix astragali preparata炙黄芪探针法PCR鉴定试剂盒 中药材鉴定试剂盒/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-4周 Ochroconis gallopava奔马赭霉LAMP试剂盒 动物病原微生物检测（科研用）/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-3周 Nodus nelumbinis rhizomatis藕节LAMP鉴定试剂盒 中药材鉴定试剂盒/定做种属检测试剂盒 50次 低温 负20度 一年 2-4周 台盼蓝染色法细胞活力检测试剂盒细胞葡萄糖激（glucose kinase）比色法定量检测试剂盒 20次 固氮根瘤菌培养基 英文名称：Nitrogen-fixing Rhizobium medium 产品规格：250g 体液糖类总量铁比色法定量检测试剂盒 20次 免疫细胞化学AP联NBT/BCIP*间接检测试剂盒（含一抗和AP二抗） 10次 血液脯氨酰肽（prolinase）比色法定量检测试剂盒 20次 组织多巴胺（dopamine）比色法定量检测试剂盒 20次 食物总抗氧化能力（TAC）比色法（DDPH）定量检测试剂盒 50次 组织组蛋白脱乙酰化（HDAC）总活性比色法定量检测试剂盒 20次 营养琼脂 英文名称：Nutrient Agar 产品规格：250g 孟加拉红培养基颗粒 英文名称：Rose Bengal Medium 产品规格：300ml/袋*10 载玻片细胞ERK蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒 10/20次
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