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CFSE细胞增殖与毒性检测试剂盒
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  CFSE细胞增殖与毒性检测试剂盒的详细资料:

中文名称:CFSE细胞增殖与毒性检测试剂盒

英文名称:

产品规格:500T

产品货号:BJ-01X6519

荧光染料CFSE(CFDA-SE),是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料,可以标记活体细胞。CFSE是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料,可以结合细胞内的蛋白质。CFSE在结构上将酚羟基部位改造成AM 体,所以自身不发荧光,荧光背景低,脂溶性高,能够轻易穿透细胞膜,在活细胞内与胞内蛋白共价结合,进入细胞内的CFSE的AM 部位能被细胞内酯酶水解发出绿色荧光。CFSE的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合,固定在细胞内,不会漏出细胞外。CFSE 进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核,在细胞核的荧光强。

在细胞分裂增殖过程中,CFSE的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减,标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半,根据这一特性,它可被用于检测细胞增殖,细胞周期的估算及细胞分裂等方面。CFSE标记细胞的荧光非常均一,优于以前使用的其他细胞示踪荧光探针如PKH26,并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均一。在细胞分裂增殖过程中,CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,荧光强度变为亲代细胞的一半,通过流式细胞仪(FL1 通道)根据荧光强度的不同,可检测出未分裂细胞,分裂一次(1/2的荧光强度),二次(1/4的荧光强度),三次(1/8的荧光强度),以及更多分裂次数的细胞。CFSE可检测分裂次数多达八次甚至更多。经CFSE标记的细胞可用于体外和体内增殖研究,且具有不会使邻近细胞染色的功能。

CFSE标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久,它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。CFSE 毒性小,不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单,且不用放射性同位素,不存在安全隐患。可以更快速,更准确和更安全地得到想要的实验数据。

CFSE标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。常用于淋巴细胞的增殖检测,也可以用于成纤维细胞、NK 细胞等其它细胞的增殖检测。

CFSE标记细胞呈绿色荧光,荧光波长:λex=496 nm,λem=516 nm。流式检测时的激发波长可以选择488nm,此时的发射波长为516nm,使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。CFSE标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞增殖外,还可用荧光酶标板定量活细胞数目,或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。

储存条件:CFSE须-20℃避光保存,注意防潮。

有效期:六个月。

细胞培养操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备F-12K培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 细胞处理:

1) 复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。


QQ截图20220509112004.png

细胞培养方法:

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔,通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0~10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小时,使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度(如无570nm 滤光片,可以使用560-600nm 的滤光片)。

8、结果分析

a、细胞的存活率:将各测试孔的OD 值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

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