WHO对HIV诊断试剂的评价
　 1998年，为向其成员国提供HIV实验室诊断方面的建议，世界卫生组织AIDS规划署(GPA)启动了评价商品化HIV抗体诊断试剂的计划，目前也涵盖了对抗原试剂及抗原／抗体试剂的评价。该计划对一系列商业化诊断试剂的评价结果，为卫生部门负责人有针对性地选择诊断试剂提供了参考，同时也为诊断试剂的评价提供了标准。截至目前，所评价的试剂包括血清／血浆抗体检测试剂、快速检测(S／R)试剂、全血快速检测试剂、尿液／唾液检测试剂及抗原／抗体检测试剂。自1998年GPA启动商品化HIV诊断试剂评价计划至今，已发布6份评价报告，评价的商业化试剂有63种之多，其中包括ELISA试剂、S／R试剂和WB试剂，检测的样本包括血清、血浆、全血、唾液和尿液等。

一、所评价的试剂以及所用的样品

评价报告中所使用的试剂均为目前广为应用的商品化试剂，由商无偿提供。不同的诊断试剂检测样本不同，针对诊断试剂检测样本的要求选择相应的评价样品，主要包括血清／血浆样本、全血样本、唾液样本和尿液样本。

1．血清／血浆样品的选择

WHO评价过的检测血清／血浆样本的试剂有ELISA抗体试剂、S/R试剂和ELISA抗原／抗体试剂，不同原理的试剂在样本选择方面略有不同。

ELISA抗体试剂和S／R试剂在样本选择上基本相同，所用样品主要由三部分组成：WHO血清盘、阳转系列血清盘和HIV-1 O型血清，其中，HIV-1 O型血清不是必须选择的。以WHO于1998对人类血清HIV抗体检测试剂评价为例，ELISA抗体试剂和S／R试剂所用的样品*相同。WHO血清盘包括595份血清样品，分别来自不同地区，包含不同亚型，其阳性与阴性样品比例约为1：2，具体如表17．4所示。8个阳转系列血清盘购自美国BBI(Boston Biomedica Inc)公司，其编号分别为PRB 904、PRB909、PRB 911、PRB 912、PRB914、PRB 916、PRB 917和PRB 918，为8个不同患者不同时期的系列阳转血清。6份HIV-l O型血清经线性免疫分析试验进行确证，并用HIV-1 O型及M型特异性引物进一步确认。WHO血清盘及阳转系列血清盘应用于所有评价试剂，而HIV-1 0型血清仅用于评价能检测HIV-1 O型的试剂盒。

ELISA抗原／抗体试剂的样品选择与上述两者略有差别，在WH0血清盘及阳转系列血清盘的选择原则上，三者无明显区别，除上述两种评价样品外，抗原／抗体试剂评价样品还有操作血清盘，以2004年wHO对抗原／抗体试剂的评价报告为例，操作血清盘购自：BBI，包括一套由不同滴度抗HIV-1抗体血清组成的抗体血清盘和一套由不同滴度p24抗原血清组成的抗原血清盘，前者包括25份血清，后者包括19份血清，血清WB及抗原检测结果由BBI提供。

2．全血样品的选择

全血试剂评价样品包括三部分：WHO全血血样品盘、其对应的血清盘和BBI阳转系列血清盘。以WHO 2000年对全血诊断试剂的评价为例，250份全血样品收集于ED-TA抗凝管中，同时收集了与其对应的血清样品，250份样品中，170份为抗HIV-1阴性，80份为阳性。8个阳转系列血清盘购自美国BBI公司。

3．尿液及唾液样品的选择

尿液及唾液样品包括两部分：WH0尿液或唾液样品盘及其对应的血清样品。因唾液及尿液试剂不能检测血清样品，因此选择的样品不包括BBI阳转系列血清盘。以WHO 2002年对尿液及唾液诊断试剂评价为例，介绍样品选择及预处理。

1)尿液样品：WHO共收集了300份尿液样品及其对应的血清样品，其中，93份为HIV阳性，207份为HIV阴性。先将新鲜的尿液收集至无菌容器中，然后无菌分装至聚丙烯螺口管中，不添加防腐剂，于2～8℃保存。所有样品检测前200g离心1min，然后转移至无菌管中。所有血清样品于一30℃冻存，冻融1或2次。

2)唾液样品：WH0共收集了222份唾液样品及其对应的血清样品，其中，75份为HIV阳性，147份为HIV阴性。根据不同唾液诊断试剂的要求对样品进行预处理。血清样品保存方式与尿液对应血清样品相同。

二、实验室操作以及参比试剂的选择

所有检测均严格按试剂说明书操作，通常评价一类试剂的所有实验由一人操作完成，除WB以外的其他试剂，对一份样品若*次检测结果为阳性，则对该样品重复检测一次，若两次结果不一致，再重复一次实验，以三次检测中两次相同的结果作为该样品检测结果，若三次检测结果各不相同，则将结果记为不确定。由于阳转系列血清价格昂贵，对阳转系列血清的检测只进行一次。对ELISA检测结果将根据试剂要求用酶标仪读取数据。S／R及WB试剂检测分别由三人独立地判定结果，以结果相同的两次作为zui终结果，若三人判定结果都不相同，则将结果记为不确定。

在待评价试剂检测前，先用参比试剂对评价用样品进行检测。在所有WHO HIV诊断试剂评价报告中，所用的参比试剂均为血清／血浆的检测试剂。在血清／血浆样品诊断试剂的评价中，参比试剂的检测样品与待评价试剂的相同；而在其他类型样品(全血、尿液、唾液等)的诊断试剂评价中，参比试剂的检测样品为其他类型样品所对应的血清／血浆样品。

参比试剂包括两种类型：初筛试剂和确证试剂。初筛试剂一般为ELISA诊断试剂，至少应包括两种试剂(有时用确证试剂替代，如对HIV-2阳性样品的检测)；确证试剂一般为WB试剂和(或)LIA试剂，对于HIV-1阳性样品一般只需一种确证试剂，而对于HIV-2阳性样品则需三种确证试剂，来区分单纯HIV-2感染和与HIV-1共感染。

以S／R诊断试剂评价为例。S／R试剂检测样品对应的血清／血浆中，所有HIV阴性及HIV-1阳性样品先经两种ELISA诊断试剂筛查，两种诊断试剂为VironostikaHIV Uni-Form II plus O(Organon Teknika)和the Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Be-hringwerke AG)，两种试剂检测均为阴性，则认为其为阴性，若任一试剂检测为阳性，则用相同试剂双份复试，若任一试剂或两试剂重复仍为阳性，则用免疫印迹试验进行确证，确证试剂为InnoLIA HIV(Innlgenetics)。对于HIV-2阳性样品，为了区分单纯HIV-2感染和与HIV-1共感染，先用两种wB试剂对其进行检测，两种试剂为West-ern Blot HIV-1(WB HIV-1)[GenelabsDiagnostics，HIV Blot，(version 1．2)]和NEWLAV BLOT II(WB HIV-2)(SanofiDiagnostics Pasteur)，若两种检测试剂均为阳性或结果不确定，则再用Pepti-Lav 1+2(Sanofi Diagnostics Pasteur)进行确证。若WB结果中出现两条env条带，无论有无gag、pol条带，结果都为阳性；若WB结果中无任何条带为阴性；其他检测结果为不确定。参比试剂检测不确定的样品，在试剂评价中不予应用。

三、评价的技术指标

WHO HIV体外诊断试剂的评价指标有灵敏度、特异性、阳性预期值、阴性预期值、可信限、δ值、重复性，前文已做了详细介绍，不再赘述，仅就其特殊的评价指标做简要介绍，包括阳转系列血清相对敏感性系数、操作血清检测灵敏度、结果判定变异度。

1．阳转系列血清相对敏感性系数

除尿液及唾液检测试剂外，其他试剂都对BBI阳转系列血清进行了检测，以参比试剂对阳转系列血清检测结果作为对照，WH0选择Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus(Behringwerke AG)作为参比试剂，对每一阳转血清盘，Enzygnost Anti-HIV 1／2 Plus检出的*份系列血清定为0，将待评价试剂检测结果与其作对比，确定待评价试剂检出的*份系列血清与参比试剂的0血清的位置关系。对任一阳转血清盘而言，若待评价试剂检测出*份为阳性的样品的位置在参比试剂的O血清位置前2位，则该待评价试剂检测该转血清盘的相对敏感性系数为一2。反之，若在参比试剂的0血清位置后3位，则相对敏感性性系为+3。如此类推，对全部阳转血清盘而言，待评价试剂的阳转血清相对敏感性系数为所有单独的相对敏感性系数的均值，并计算95％可信限，以此来评价试剂对窗口期样品的检测能力，数值越小，试剂越灵敏。

2．操作血清检测灵敏度

为评价HIV Ag／Ab试剂对不同滴度抗原及抗体血清的检测能力，在HIV Ag／Ab试剂评价中引入了操作血清盘检测。操作血清盘有两种：抗体操作血清盘和抗原操作血清盘，分别由不同滴度抗体和p24抗原的血清组成。用待评价Ag／Ab试剂分别检测抗体及抗原操作血清盘，检测结果与。BBI提供的抗体wB及抗原试剂检测结果做比较，得出待评价试剂检测操作血清盘的灵敏度。

3．结果判定变异度

当试剂检测结果不是由仪器而是由操作者人为读取时，不同操作者读取的结果可能存在差异。如WB及S／R试剂检测结果的读取，此情况下，结果的读取通常由三人独立完成，zui终结果为两人判断相同的结果，若三人结果都不同，则结果为不确定。结果判定变异度为结果判定不一致的血清占总血清数的百分比：结果判定变异度=结果判断不一致血清/总血清数100％

4．附加分析

除上述评价指标外，WHO还制定了一套评分系统，由实验操作者对试剂满意度、试剂的操作简便性、应用于小实验室的可行性等进行评估。

四、WHO评价试剂的具体内容

WHO对HIV诊断试剂的评价结果以图表的形式列出，主要包括以下几方面的内容：①试剂的一般特性；②待评价试剂与参比试剂结果比较；③操作方面的特点；④试剂应用的简便性及应用于小实验室的可行性；⑤阳转系列血清检测结果比较；⑥操作血清盘检测结果比较(HIV Ag／Ab试剂)。

1．试剂的一般特性

试剂的一般特性包括以下几个方面：①试剂商及产地；②试剂类型，按试剂原理分类，如双抗原夹心ELISA、免疫层析试剂；③试剂、原料，如包被抗原或抗体类型，是重组抗原还是合成抗原，是HIV哪一段的抗原，是单克隆抗体还是多克隆抗体，针对HIV哪一段抗原的抗体；④固相支持物的类型，如ELISA 试剂一般为12×8的微孔板条；⑤检测样本的类型为血清／血浆、全血、尿液或唾液等；⑥每个试剂盒所包含的反应数；⑦批号及失效日期；⑧储存时间及条件；⑨每一反应所需样本量；⑩检测一次所需时间及处理的样品量；⑨结果读取方式，如wB试剂为肉眼读取，ELISA为分光光度计读取并注明波长；⑥每人份的市场指导价。

2．待评价试剂与参比试剂结果比较

即以参比试剂检测结果作为标准来评价待评价试剂，其评价指标包括以下几方面：①灵敏度及灵敏度95％可信限；②特异性及特异性95％可信限；③不确定结果百分率；④结果判定变异度；⑤阳性预期值；⑥阴性预期值。

3．试剂盒操作方面的特点

主要包括以下几方面：①试剂盒的大小(宽-长-高)；②储存条件；③反应条件；④反应终止后的稳定性；⑤试剂盒中各组分开封后的稳定性及储存条件，如ELISA试剂盒中的微孔板条、阴阳性对照、样品稀释液、酶结合物等；⑥每次实验每一试剂盒所能检测的zui大和zui小样品数；⑦每次检测中所需的对照及其数量；⑧每次检测所需时间；⑨试剂盒未提供但检测所需的仪器设备；⑩结果判断法则，包括cut-off值计算公式；⑥灰区或无效结果的判定。

4．操作者对试剂盒的总体评价

WHO制定了一套评分系统，由实验操作人员对试剂盒做出总体评价，主要包括以下几方面：①试剂盒操作步骤，1～2步为6分，3～5步为3分，>5步为1分；②试剂盒说明书情况，“好”为2分，“需改进”为1分；③试剂盒及其组分的包装及标签，“好”为2分，“需改进”为1分；④总分，上述三项分数之和；⑤操作者对试剂盒的建议。评分越高，操作者对试剂盒的评价越高。

5．操作简便性分析  

WHO对试剂盒操作的简便性分析也制定了一套评分系统，以ELISA HIV Ag／Ab试剂为例，主要包括以下几方面：①实验中需操作者准备的试剂、酶标板条、底物、洗液、酶标抗原、稀释血清，不需准备为1分，需准备为0分；②试剂盒中组分开封或稀释后的稳定性，标明开封或稀释后有效期的为1分，开封或稀释后不稳定的为0分，试剂盒中的每一组分作为一项，如酶标版条、样品稀释液、阴阳性对照等；③试剂盒未提供但检测中需要的设备或试剂，如加样排枪、样品稀释管、终止液等，不需准备为1分，需要准备为0分；④操作者对试剂盒总体评价的总分；⑤总分，上述4项得分的综合；⑥结论，<20分为不简便，≥20分而≤25分为简便，>25分为非常简便。

6．应用于小实验室的可行性

WH0制定了一套评分系统来评价试剂是否适用于小实验室，主要包括以下几方面：①敏感性，100％为5分，98％～100％为3分，<98%为0分；②特异性，>98％为5分，95％～98％为3分，<95％为O分；③反应温度，室温反应为3分，非室温反应为1分；④效期，>1年为5分，6个月～1年为2分，<6个月为1分；⑤每人份价格，≤1美元为3分，>1美元而≤2美元为2分，>2美元为1分；⑥操作简便性，非常简便为5分，简便为3分，不简便为1分；⑦检测每人份的操作时间，<10min为3分，10～30min为2分，>30min为1分；⑧是否需要洗板机或搅拌器，不需要为3分，需要为1分；⑨结果判定，若为肉眼读取：结果判定变异度≤3％为5分，结果判定变异度>3％为3分，若为机器读取为1分；⑩总分，为以上9项得分之和；⑩结论，得分<23为不适用，得分≥23而≤30为适用，得分>30为非常适用。

7．阳转系列血清检测结果

将每种待评价试剂对每个血清盘中的每一份系列血清检测结果列于表中，同时表中列出参比试剂检测结果，将两结果做比较，计算出阳转血清相对敏感性系数(详见453页)，并计算每一试剂检测所有系列血清所得的相对敏感性系数均值和95％可信限。

8．HIV-1 O型血清盘检测结果

若待评价试剂能检出HIV-l O型样品，可用HIV-1 O型血清盘对其进行评价，将检测结果及确证试剂检测结果作对比，来评价试剂对HIV-1 O型样品的检测能力。

9．操作血清盘检测结果

对于HIV-1 Ag／Ab检测试剂，还需用由不同滴度抗原和抗体血清组成的操作血清盘对其进行评价，将检测结果与BBI提供的结果做比较，来评价试剂对不同滴度样品的检测能力。

近年来，随着对HIV研究的不断深入和实验室诊断技术不断发展，HIV诊断试剂研究工作取得了长足进展，大量新技术、新试剂不断涌现。WHO对商品化诊断试剂的评价，不仅提供了许多常规评价指标，如敏感度、特异性等，还对试剂操作简便性、应用于小实验室的可行性等进行了评估，为医疗卫生部门选择试剂提供了依据，也为诊断试剂的评价提供了很好的参考。