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免疫荧光实验过程常见问题分析
点击次数:121 更新时间:2024-05-06

       免疫荧光实验原理很简单,其实就是使用荧光二抗,并在荧光显微镜下采集图像,其它的和IHC或ICC区别不大。实验过程常见问题分析:

1、目标蛋白的荧光很弱,导致组间差异并不明显,造成假阴性结果

这种情况出现后,首先要检查一下抗体对不对,是否适用于你的预处理组织。一个典型的例子就是,有些抗体只适用于冰冻切片,但若将其应用于石蜡切片,就会造成弱标记或无标记现象。

然后通过文献等查找一下目标蛋白在该组织或细胞的表达丰度如何。若该蛋白本身表达就很少,那就没啥可说的,你的结果应该没问题。

此外,如果抗体修复不充分,抗原表位未全暴露,也会出现弱标记现象。比如,尽管大多数抗体都是在酸性环境中修复,但是也存在少量的抗体需要在碱性环境中修复,建议查看抗体说明书,严格按照其修复条件进行实验。

2、目标蛋白的荧光太强,甚至形成非特异性的标记,一些背景染色可能被误认为阳性区域,造成假阳性结果

这种情况一般出现在抗体浓度过高而漂洗又不充分的时候。多余的抗体会吸附在组织上,造成荧光图像整体高背景。

改进方法是适当降低一抗或者二抗的浓度,增加漂洗时间,一般能够有所改善。

3、DAPI染细胞核时,加入的试剂太多,造成高背景染色

现在都是使用的防荧光衰减DAPI试剂,使用时滴上一滴就能将细胞核标记。

但是这也带来一个小问题。滴加的量太多时,会造成整张图像呈现出蓝色的背景。采集得到的图像会很不好看,如果单纯使用γ值曲线去调整,图像中的细胞核会呈现出假假的感觉,像是P上去的。

因此,滴加的DAPI不要太多,只需覆盖上薄薄的一层即可。事实上,个人认为只要切片没有暴露在自然光或者激发光之下,荧光的自然衰减并没有想象中那么快。

4、组织切片预处理不当或采用石蜡切片,导致高背景染色

如果组织切片,尤其是石蜡切片脱蜡环节不彻di,也会造成区域性的非特异性标记。建议脱蜡一定要彻di,脱蜡前充分烤片也可以帮助脱蜡。

实验过程中,玻片干燥了,同样会造成高背景或大面积的非特异性标记。漂洗环节和抗体孵育环节最容易出现干片现象,尤其是大批量实验时,一定要注意。使用免疫组化专用笔画个圈,可以有效改善。

5、采集图像过程不当,导致原始图像不佳,直接影响后续半定量分析

采集图像时不要对每一张图像都加上标尺,否则后期采用Image J或者IPP进行分析时,这些标尺会对结果造成影响。

采集图像时,速度要快。如果激发光很长时间对准目标区域,此区域内的荧光衰减会极快,有经验的人都知道,不必多说。因此,目标区域较小时,一定要尽量快速采集,减少人为实验误差。

采集图像时,必须固定一个γ值,不可以在采集过程中修改。因为,γ值确实可以改善图像的某些瑕疵,但是这样一来,图像的荧光分布和强度会受到γ值的极大影响。调整幅度太大,更会造成荧光假假的感觉,非常失真。

当然了,后期半定量分析时,如果一定要调整γ值,那也是对整批次图像的统一调整,而不是某几张图像。千万别走入造假的险境之中。


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