细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

中文名称：LIMK2抑制剂(T56-LIMKi)

英文名称：T56-LIMKi

产品规格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg

产品货号：BJ-01X8521

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。

8、结果分析

a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

大鼠 IL27 基因全长ORF克隆石蜡切片组织衰老特异性晚期脂褐素铁还原法  10次

大鼠 IL21 基因全长ORF克隆（SCHMORL）间接染色试剂盒  

大鼠 IL8RB 基因全长ORF克隆石蜡切片组织衰老特异性晚期脂褐素铁还原法  50次

大鼠 IL4R 基因全长ORF克隆（SCHMORL）直接染色试剂盒  

大鼠 IL2RG 基因全长ORF克隆细胞衰老特异性晚期脂褐素高碘酸希尔（PAS）法  50次

大鼠 IL1R2 基因全长ORF克隆品红亚硫酸盐（FUCHSIN SULFITE）原位染色试剂盒  

大鼠 IL25 基因全长ORF克隆全组织衰老特异性晚期脂褐素高碘酸希尔（PAS）法  10次

大鼠 IL19 基因全长ORF克隆品红亚硫酸盐（FUCHSIN SULFITE）原位染色试剂盒  

大鼠 TNFRSF18 基因全长ORF克隆冰冻切片组织衰老晚期特异性脂褐素高碘酸希尔（PAS）法  50次

大鼠 IL18R1 基因全长ORF克隆品红亚硫酸盐（FUCHSIN SULFITE）原位染色试剂盒  

大鼠 IL17RA 基因全长ORF克隆石蜡切片组织衰老特异性晚期脂褐素高碘酸希尔（PAS）法  10次

LIMK2抑制剂(T56-LIMKi)MYCBP2  MYC结合蛋白2抗体 规格: 0.2ml

PNPT1  多核苷酸磷酸化蛋白抗体 规格: 0.2ml

FOXO3A  叉蛋白O3A抗体 规格: 0.2mlphospho-MAX protein(Tyr123)  磷酸化Myc基因相关X因子抗体 规格: 0.1ml

PDHB  丙酮酸脱E1β亚单位抗体 规格: 0.2ml

C12ORF61  12号染色体开放阅读框61抗体 规格: 0.2mlM2-PK/PKM2  小鼠抗丙酮酸激-M2抗体 规格: 0.1ml

Histone H3 (Di Methyl K27)  三甲基化组蛋白H3抗体 规格: 0.1ml

SMAD9  SMAD家族9抗体 规格: 0.2ml

AP2M1/AP-2?  接相关蛋白复合体AP-2μ链1抗体 规格: 0.2mlGTSE-1  G2期/S期应答相关蛋白1抗体 规格: 0.2ml

Mouse Anti-Guinea pig IgG/Bio  标记的小鼠抗豚鼠IgG 规格: 0.1ml

RAB40B  RAS基因家族蛋白RAB40B抗体 规格: 0.2ml

CRMP4/DRP3  脑衰蛋白反应调节蛋白4抗体 规格: 0.2ml