操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。

8、结果分析

a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

中文名称：mTOR激酶抑制剂(CC-223)

英文名称：CC-223

产品规格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

产品货号：BJ-01X7848

细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

二咖啡酰菊苣酸

英文别名：   (2r,3r)-2,3-bis[[(e)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy]butanedioic acid

CAS登录号：   70831-56-0

分子式：   C22H18O12

分子量：   474.37

3,4,5-三咖啡酰奎宁酸

英文别名：   (1alpha,3R,4alpha,5R)-3,4,5-Tris[[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propen-1-yl]oxy]-1-hydroxycyclohexanecarboxylic acid

CAS登录号：   86632-03-3

分子式：   C34H30O15

分子量：   678.59

5,7-二羟基色原酮

英文别名：   5,7-Dihydroxychromen-4-one

CAS登录号：   31721-94-5

分子式：   C9H6O4

分子量：   178.14

伽升沃D

英文名：   Garcinone D

英文别名：   1,3,6-Trihydroxy-8-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-7-methoxy-2-(3-methyl-2-buten-1-yl)-9H-xanthen-9-one

CAS登录号：   107390-08-9

分子式：   C24H28 O7

伽升沃 C

英文名：   Garcinone C

英文别名：   1,3,6,7-Tetrahydroxy-8-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-2-(3-methyl-2-buten-1-yl)-9H-xanthen-9-one

CAS登录号：   76996-27-5

分子式：   C23H26O7

水飞蓟汀

英文名：   Silicristin

英文别名：   hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-5-benzofuranyl]-2,3-dihydro-3,5,7-trihydroxy-,(2R,3R)

CAS登录号：   33889-69-9

分子式：   C25H22O10

水飞蓟宁

英文别名：   3R,8R)-2,3,3aβ,7a-Tetrahydro-7aβ-hydroxy-8-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-[(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-2H-1-benzopyran-2-yl]-3α,6α-methanobenzofuran-7(6H)-one

CAS登录号：   29782-68-1

分子式：   C25H22O10

分子量：   482.44

刺囊酸

英文别名：   (3beta,16alpha)-3,16-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid

CAS登录号：   510-30-5

分子式：   C30H48O4

分子量：   472.7

杯苋甾酮

英文别名：   (22R,24S,25S,28R)-2β,3β,14,20,22,28-Hexahydroxy-6-oxo(26-13C)-5β-stigmasta-7-ene-26-oic acid γ-lactone

CAS登录号：   17086-76-9

分子式：   C29H44O8

分子量：   520.65

原花青素B1

英文名：   Proanthocyanidin B1

英文别名：   2R,2'R,3R,3'S,4β)-3,3',4,4'-Tetrahydro-2α,2'α-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-4,8'-bi[2H-1-benzopyran]-3,3',5,5',7,7'-hexol

CAS登录号：   20315-25-7

分子式：   C30H26O12

蒙花苷

英文名：   Buddleoside

英文别名：   7-[[6-O-(6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)-beta-D-glucopyranosyl]oxy]-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-benzopyran-4-one

CAS登录号：   480-36-4

分子式：   C28H32O14

mTOR激酶抑制剂(CC-223)油红染色试剂盒  100T  改良EC肉汤(mEC+n)颗粒 Modified EC Broth 225ml/袋*10

茜素红染色液(ph4.2)  10ml  100µL 即用型GFP标签蛋白裂解液 GFP-Tagged Protein Lysate -20℃保存

BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒  共100ml  BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit2 ug pTCK303 pTCK303 低温运输，-20℃保存

MASSON三色染色试剂盒(亮绿，用于胶原纤维染色)  8ml/瓶/盒  4次 大提柱式动物DNAout Maxi Column Animal DNAOUT 常温

苏木素染液  100ml  Haematorylin Staining Solution2 ug pDR195 pDR195 低温运输，-20℃保存

结晶紫染色液  100ml  50%卵黄乳液 50% egg Yolk emulsion 5ml*10

苏木素-伊红(H-E)染液  200ml  100mL 琼脂糖凝胶 4B Sepharose 4B 4-8℃保存

伊红染液  100ml  50T 蟹特定基因序列PCR检测试剂盒  低温运输，-20℃保存

姬姆萨染液(10×)  25ml  200 mL 大鼠 NK 细胞分离液1.068 Cell Separation Solution -20℃保存

内质网红色荧光探针(ER-Tracker Red)  20μL  100mL Glycylglycine Buffer,0.5M,pH8.0   Glycylglycine Buffer,0.5M,pH8.0   常温保存

DiOC6(3)碘化物  10mg  3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodide七叶苷生化管  20支