中文名称：EGFR/HER2双重抑制剂(Pyrotinib)

英文名称：Pyrotinib

产品规格：1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg

产品货号：BJ-01X8549

细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

人 IL11Ra 转录变体1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签石蜡切片脂质过氧化物异构前列腺素（ISOPROSTANE）荧光染色试剂盒  10次

人 IGFII / IGF2 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签脂质过氧化物异构前列腺素（ISOPROSTANE）ELISA定量测定试剂盒  48/96次

人 BMP-5 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签脂质过氧化物异构前列腺素（ISOPROSTANE）高效液相色谱 （HPLC）分析试剂盒  20次

人 NFkB1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签细胞脂质过氧化物反式十八碳四烯酸（cis-parinaric acid）比色法测定试剂盒  20次

人 DDR2 Kinase / CD167b 转录变体1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签细胞脂质过氧化物反式十八碳四烯酸（cis-parinaric acid）细胞流式分析试剂盒  10次

人 KLK-13 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签冰冻切片脂质过氧化物反式十八碳四烯酸（cis-parinaric acid）荧光染色试剂盒  10次

人 JAM-A 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签石蜡切片脂质过氧化物反式十八碳四烯酸（cis-parinaric acid）荧光染色试剂盒  10次

人 EphB6 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签脂质过氧化物反式十八碳四烯酸（cis-parinaric acid）ELISA定量测定试剂盒  48/96次

人 Protein C 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签脂质过氧化物反式十八碳四烯酸（cis-parinaric acid）高效液相色谱 （HPLC）分析试剂盒  20次

人 TPOR 基因全长ORF克隆 (表达载体), 带FLAG标签细胞脂质过氧化物（linoleic acid）比色法测定试剂盒  20次

人 CD50 / ICAM3 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签细胞脂质过氧化物（linoleic acid）细胞流式分析试剂盒  10次

EGFR/HER2双重抑制剂(Pyrotinib)ERAB/HSD17B10  内质网Aβ相关结合蛋白抗体 规格: 0.1mlBrain protein CG6  脑蛋白CG6抗体 规格: 0.2ml

GFOD2  葡萄糖果糖还原2抗体 规格: 0.2ml

EGR3  早期生反应蛋白3抗体 规格: 0.1mlDVL2  蓬乱蛋白2抗体 规格: 0.2ml

phospho-EGFR (Tyr1016)  磷酸化表皮生因子受体抗体 规格: 0.1ml

DISC1(NT)  DISC1 N端抗体 规格: 0.2mlADAMTSL2  整合素样金属蛋白与凝样2蛋白抗体 规格: 0.2ml

Sulfatase 1  硫酸酯1抗体 规格: 0.2ml

Phospho-Tuberin/TSC2(Ser1798)  磷酸化结节性硬化蛋白抗体 规格: 0.1mlPPAR gamma  过氧化活化增生受体γ抗体 规格: 0.2ml

Myt1  髓鞘转录因子1抗体 规格: 0.2ml

BRD1  BRD1蛋白抗体 规格: 0.2mlTRPV4/TRP12  瞬时受体电位蛋白12抗体 规格: 0.2ml

Destrin 19/ADF  肌动蛋白解聚因子19抗体 规格: 0.1ml

eIF4G  真核翻译起始因子4G抗体 规格: 0.1mlNIK/MAPKKK14  NFkB诱导激抗体 规格: 0.1ml

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。

8、结果分析

a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)