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BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒
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BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒公司正在出售的产品:沉降菌测试培养基 1瓶 BCaP-37细胞株 BCaP-37 低温运输和保存Baird-Parker琼脂基础颗粒 Baird-Parker Agar Base 300ml/袋*1010次 克必隆eTS RNA荧光探针制备试剂盒 250mL NP40 Lysis Buffer(NP40裂解液) NP40 Lysis Buffer 常温保存
  BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒的详细资料:

细胞培养操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备F-12K培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 细胞处理:

1) 复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

中文名称:BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒

英文名称:BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit

产品规格:共100ml

产品货号:BJ-01X6593

BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒是一种用于免疫组化显色、Western 等膜显色和诱导多功能干细胞iPS 鉴定等的试剂盒。

BCIP/NBT 是碱性磷酸酯酶的常用底物。在碱性磷酸酯酶的催化下,BCIP 会被水解产生强反应性的产物,该产物会和NBT 发生反应,形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

本试剂盒可以用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS 的鉴定,也可以用于Western 等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。

组份规格:

试剂A:碱性磷酸酯酶显色缓冲液 100ml

试剂B:BCIP 溶液(300X) 350μl

试剂C:NBT 溶液(150X) 700μl

使用说明

1. 对于组织切片或细胞样品或膜,在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后,用适当洗涤液洗涤3-5 次,每次3-5 分钟。对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品,在适当固定后,也用适当洗涤液洗涤3-5 次,每次3-5 分钟。

2. 按照如下比例依次加入各溶液,混匀后即配制成BCIP/NBT 染色工作液,配方如下:试剂A:碱性磷酸酯酶显色缓冲液 3mL试剂B:BCIP 溶液(300X) 10μL试剂C:NBT 溶液(150X) 20μL染色工作液总体积:3.03mL

3. 后一次洗涤完毕后,去除洗涤液,加入适量BCIP/NBT 染色工作液,确保能充分覆盖样品。

4. 室温避光孵育5-30 分钟或更长时间(可长达24 小时),直至显色至预期深浅。

5. 去除BCIP/NBT 染色工作液,用蒸馏水洗涤1-2 次即可终止显色反应。

6. 对于组织切片或细胞样品,显色反应终止后,如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色,以便于观察。对于膜,显色反应终止后,可以室温晾干避光保存。

储存:4℃,有效期一年。


QQ截图20220509112004.png

细胞培养方法:

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔,通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0~10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小时,使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度(如无570nm 滤光片,可以使用560-600nm 的滤光片)。

8、结果分析

a、细胞的存活率:将各测试孔的OD 值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

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