细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

中文名称：ES2细胞增殖抑制剂(Coumestrol)

英文名称：Coumestrol

产品规格：1mL(10mM)|5mg|10mg

产品货号：BJ-01X8539

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。

8、结果分析

a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

大鼠 CD95 / Fas 基因全长ORF克隆活体组织氧化应激活性氧（ROS）荧光测定试剂盒（过氧亚硝基阴离子）  20次

大鼠 CXCL2 / MIP-2 基因全长ORF克隆真/酵母细胞内氧化应激活性氧（ROS）荧光测定试剂盒（过氧亚硝基阴离子）  20次

大鼠 CRP 基因全长ORF克隆植物氧化应激活性氧（ROS）荧光测定试剂盒（过氧亚硝基阴离子）  20次

大鼠 CystatinC / CST3 基因全长ORF克隆体液氧化应激活性氧（ROS）荧光测定试剂盒（过氧亚硝基阴离子）  20次

大鼠 CXCL1 基因全长ORF克隆细胞内氧化应激活性氧（ROS）比色法测定试剂盒（单线态氧气）  20次

大鼠 CCL5 基因全长ORF克隆组织氧化应激活性氧（ROS）比色法测定试剂盒（单线态氧气）  20次

大鼠 CCL4 基因全长ORF克隆体液氧化应激活性氧（ROS）比色法测定试剂盒（单线态氧气）  20次

大鼠 CCL20 基因全长ORF克隆植物氧化应激活性氧（ROS）比色法测定试剂盒（单线态氧气）  20次

大鼠 CCL2 / MCP-1 基因全长ORF克隆单线态氧气清除（scavenging）活性比色法筛选试剂盒  20次

大鼠 BOK 基因全长ORF克隆细胞内氧化应激活性氧（ROS）荧光测定试剂盒（单线态氧气）  20次

大鼠 CD62E / E-Selectin 基因全长ORF克隆组织氧化应激活性氧（ROS）荧光测定试剂盒（单线态氧气）  20次

ES2细胞增殖抑制剂(Coumestrol)Phospho-CEBP alpha (Thr222/226)  磷酸化转录调节因子CEBP α 抗体 规格: 0.1ml

Rabbit anti-mouse Kappa light chain/PE-Cy5.5  PE-Cy5.5标记的兔抗小鼠k链 规格: 0.1ml

Mouse Anti-Rabbit IgM/PE-CY5  PE-CY5标记的小鼠抗兔IgM 规格: 0.1ml

phospho-PI3K p85/PIK3R1(Tyr368)  磷酸化磷脂酰肌醇激抗体 规格: 0.1mlIGSF16/CD300C  免疫球蛋白超家族成员16抗体 规格: 0.2ml

Rabbit Anti-Guinea pig IgM/PE-Cy5.5  PE-Cy5.5标记的兔抗豚鼠IgM 规格: 0.1ml

PACAP-38  苷酸环化激活肽-38抗体 规格: 0.1ml

SPY/CCDC99  卷曲螺旋结构域蛋白99抗体 规格: 0.1mlDHRS7C  短链脱/还原家族7C抗体 规格: 0.2ml

GIMAP1  GTPIMAP家族成员1抗体 规格: 0.2ml

Phospho-MAP2 (Thr1620/1623)  磷酸化微管相关蛋白2抗体 规格: 0.1ml

BIN1  桥连整合因子蛋白抗体 规格: 0.1ml

phospho-Akt(Thr308)  磷酸化蛋白激B抗体 规格: 0.1ml