中文名称：MEK抑制剂（Cobimetinib hemifumarate）

英文名称：Cobimetinib hemifumarate

产品规格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg

产品货号：BJ-01X8597

细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二． 细胞处理：

1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

人 GNB2L1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签载玻片细胞PARP蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒  10/20次

人 CRK 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签冰冻切片组织PARP蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒  10/20次

人 STUB1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签石蜡切片组织PARP蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒  10/20次

人 PHB2 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签细胞PARP蛋白表达比色法定量检测试剂盒  10/50 次

人 FANCA 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签细胞PARP蛋白表达荧光定量检测试剂盒  10/50 次

人 ELF5 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签PARP蛋白表达西方杂交分析试剂盒  5次

人 C4BPB 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签PARP蛋白免疫共沉淀分析试剂盒  5次

人 BNIP3L 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签PARP蛋白表达ELISA定量检测试剂盒  25次

人 KLRG1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签细胞AKT蛋白表达流式细胞仪检测试剂盒  10/20次

人 SSU72 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签载玻片细胞AKT蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒  10/20次

人 NKIRAS1 基因全长ORF克隆 (表达载体), 无标签冰冻切片组织AKT蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒  10/20次

MEK抑制剂（Cobimetinib hemifumarate）phospho-E2F1 (Ser364)  磷酸化转录因子E2F-1抗体 规格: 0.1ml

BRLF1  EBV立即早期基因BRLF1抗体 0.2ml

p55/DCAF1  染色质组装因子1P55抗体 规格: 0.2ml

ID1  DNA结合抑制因子1抗体 规格: 0.1ml

Goat Anti-human IgM/FITC  FITC标记的羊抗人IgM 规格: 0.3ml

TSPYL5  睾特异性Y蛋白样5抗体 规格: 0.2ml

phospho-VAV1(Tyr160)  磷酸化鸟苷酸转换因子VAV1抗体 规格: 0.1ml

S100-A9/MRP14/CFAG/Calgranulin B  S100A9抗体 规格: 0.1ml

phospho-Myosin light chain(Ser20)  磷酸化肌球蛋白轻链抗体 规格: 0.1ml

M Cadherin  M钙粘附分子抗体 规格: 0.1ml

phospho-KCND2/Kv4.2(Thr602)  磷酸化电压门控性钾通道蛋白Kv4.2抗体 规格: 0.1ml

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。

8、结果分析

a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)