实验过程: 一、试剂准备 1. DNA模板 2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μl Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。 3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。 三、注意事项 1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。设立一个的PCR实验室。 2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。 3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 4.PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。 5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。 6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。 特点: 1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。 2. 根据沙门氏菌通用保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。 3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。 4. 一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。 5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。 6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。 储存条件:-20℃以下,有效期12个月。 产品名称 | 沙门氏菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Salmonella spp. | 货号 | BJ-R7170 |
使用方法: 一、样品采集: 1、食品样品:样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照菌检验要求进行。 2、血液样品:用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL,注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管,立即混匀。 3、粪便样品:取粪便置于灭菌的收集管中送检。 4、病灶部位样品:取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。 一、稀释 PCR 阳性对照(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例) 1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。 2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。 3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液(用带芯枪头,下同)。 4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。 5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用 6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。 7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
原理: 所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法: 在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图 2.TaqMan探针法: 探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成*同步。 俾斯麦棕Y英文名称:Bismarck brown Y分子式:419.31分子量: C18H20Cl2N8:10114-58-6 S-甲-L-半胱氨酸亚砜分子式:151.18英文名称:S- methyl -L- cysteine:6853-87-8分子量: C4H9NO3S 硫耐尔蓝英文名称:Nile blue sulfate分子式:732.85分子量: C40H40N6O6S:3625-57-8 6-溴-2-氯-3-甲喹啉分子式:256.53英文名称:6- -2- chloride -3-:113092-96-9分子量: C10H7BrClN (ΑR,ΑR)-2,2'-双(Α-N,N-二甲氨甲)-(S,S)-1,1′-双(二环己磷氢)二茂铁分子式:844.95英文名称:(alpha R, alpha R (-2,2'-) - alpha -N, N- two methyl ammonia benzene methyl) - (S, S) -1,1 '- bis (dicyclohexyl hydrogen phosphate) Er Maotie:494227-35-9分子量: C52H74FeN2P2 10* 1,4-二分子式:329.9英文名称:1,4- two iodobenzene:624-38-4分子量: C6H4I2 4--3-氟吡分子式:112.11英文名称:4- amino -3-:2247-88-3分子量: C5H5FN2 N,N'-二-BOC-1H-1-胍吡唑分子式:310.35英文名称:N, N'- two -BOC-1H-1- guanidine pyrazole:152120-54-2分子量: C14H22N4O4 黄杨碱英文名称:Huang Yangjian分子式:402.364分子量:C26H46N2O: 亚硒英文名称:Selenite分子式:128.97分子量: H2O3Se:7783-00-8 4-甲酸分子式:129.16英文名称:4- piperidine formic acid:498-94-2分子量: C6H11NO2 沙门氏菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒胎儿真皮成纤维细胞*培养基香菇 Lentinula edodes 肝英文名称:HCC-9204 费氏中华瘤菌 Sinorhizobium fredii 急性T淋巴细胞白血病小鼠腺上皮细胞*培养基 UM-UC-3(人膀胱移行细胞)5×106cells/瓶×2 免疫球蛋白G1(IgG1)天然蛋白 英文名称:Native Immunoglobulin G1 (IgG1) PIEC(猪髋动脉内细胞 )5×106cells/瓶×2 伊斯特本沙门氏菌 Salmonella eastbourne酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae MKN45(人胃细胞)苏云金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis 野生链球菌 Streptococcus ferus左旋酸芽孢杆菌 Bacillus laevolacticus 角蛋白15(KRT15)重组蛋白英文名称:Recombinant Keratin 15 (KRT15) |