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ELISA 检测常用样本处理方法
点击次数:85 发布时间:2021-09-15
  ELISA是一种快速、灵敏、准确可靠的定量分析方法。样本的处理对于 Elisa 实验的成功有举足轻重的作用。
 
  利用 ELISA 进行检测的样本类型包括:血液(血清、血浆),组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清,皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、阴道分泌物等。
 
  下面我们就常用的样本处理方法:
 
  血液样本
 
  血液采取后应尽快进行处理,使血清(浆)从与血细胞接触的全血中分离出来。
 
  Q: 血清与血浆的区别?
 
  A: 血清是血液凝固后缺少纤维蛋原的血浆,故血浆中除尚含有纤维蛋白原和 抗凝剂外,其他成份均等同于血清。
 
  Q: 选择血清还是血浆样本?
 
  A: 由于血清中缺乏很多的凝血因子,但有凝血产物。如果测凝血因子建议选择血浆样本;同时血浆中有纤维蛋白原,如果纤维蛋白原对待检测指标有影响,建议选择血清样本。
 
  大多数情况下二者均可以选择。
 
  处理方法:
 
  血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4 度过夜,然后1000×g 离心20分钟,取上清即可。这是一个让血液自然凝固的过程,温度越低,凝集越缓慢,可根据需要添加促凝剂。
 
  血浆:血浆样本需要抗凝,一般建议用2.0%EDTA,1%肝素,3.8%枸橼酸钠作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2~8度1000g离心15分钟,取上清即可检测。根据待检测目标物的性质不同选取不同的抗凝剂。
 
  枸橼酸钠(柠檬酸钠):Ca2+有凝血作用,枸橼酸钠能与血液中的钙离子形成可溶性的螯合物,从而阻止血液凝固。配成 109mmol/L的浓度和血液1:9, 106mmol/L的浓度和血液1:4
 
  缺点:血液中溶解度低,抗凝作用较弱。
 
  优点:对凝血因子有很好的保护作用,大部分凝血试验都可用枸橼酸钠抗凝。
 
  二胺四乙酸(EDTA)盐:与血液中的钙离子结合形成配位化合物, 从而阻止血液凝固。15g/L EDTA和血液 1:10
 
  优点:对红细胞和白细胞形态影响小。
 
  缺点:影响血小板的聚集。不适用于凝血实验和血小板功能相关实验的检 测。
 
  肝素:通过与抗凝血酶Ⅲ结合,增强抗凝血酶的作用,灭活丝氨酸蛋白 酶,从而可阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集,阻止血液凝固。肝素钠 1g/L 与血液 1:10
 
  优点:抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温。
 
  缺点:引起白细胞聚集。肝素抗凝血应于短时间内使用,否则放置过久血 液又可凝固。
 
  组织样本(组织样本一般是制成组织匀浆)
 
  处理方法:
 
  1)取适量组织块,于预冷 PBS(0.02mol/L, pH 7.0-7.2)中清洗去除血液, 称重后备用(组织块较大需先剪碎后再匀浆);
 
  2)可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果:首先将组织块移入玻璃 匀浆器,加入 5-10ml 预冷 PBS(组织与 PBS 的质量体积比建议为 1:5,即 1g 样 本加入 5ml PBS)进行充分研磨(有条件实验室可选用机器匀浆),该过程需在冰 上进行;得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理(超声破碎过 程中注意冰浴降温;反复冻融法可重复 2 次)。
 
  3)将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟,留取上清即可检测。
 
  4)如果样本需要长期保存,请添加蛋白酶抑制剂。根据实验需要,组织匀 浆样本可先定量总蛋白,以便于统计分析数据。某些组织样本如肝脏,肾脏,脑 组织会有假阳性反应。
 
  细胞样本
 
  根据目的物所在部位,可选择细胞裂解液或细胞培养上清作为样本。需要注意的是:
 
  因该类样本干扰因素较多,所以可能存在检测不出的情况。
 
  如果目的物是分泌型,主要在胞外,即可选择细胞培养上清作为样本;
 
  如果目的物主要存在于胞内,则建议选择细胞裂解液作为样本类型。
 
  处理方法:
 
  细胞培养上清:处理方法相对简单,取细胞培养上清,1000×g 离心 20 分 钟,取上清即可检测。
 
  细胞裂解液:
 
  1)贴壁细胞需要先用胰酶消化,离心收集细胞(悬浮细胞可直接离心收 集)
 
  2)将收集到的细胞用冷 PBS 洗 3 次
 
  3)物理方法裂解细胞(可先超声破碎细胞,再反复冻融):
 
  i 超声破碎:取适量 PBS 重悬细胞,用一定功率的超声波处理细胞 悬液,使细胞急剧震荡破裂;
 
  ii 反复冻融:将待破碎的细胞在-20 度以下冰冻,室温融解,反复 3 次,使细胞溶胀破碎;
 
  4)将标本于 2-8 度 1500×g 离心 10 分钟,收集上清备用。
 
  一般情况下,物理方法如反复冻融,匀浆等方法会比化学方法好,因为化 学方法会引入酸或碱,可能会对 elisa 实验产生影响。我们也做了相关实验来评 测化学提取液和洗涤剂对 ELISA 检测的影响,如 RIPA、TritonX-100、NP-40 和 SDS、脱氧胆酸钠、β巯基乙醇、DTT。
 
  痰液
 
  1)选择痰液中较为粘稠部分称重,加两倍于痰量的 0.1% DTT(二硫苏糖醇), DTT 的主要作用是溶解粘液,用吸管反复吹打,漩涡器振荡 15s,37 度恒温水浴振荡 5 分钟;
 
  2)加入两倍于痰量的 PBS 缓冲液继续振荡 15-20 分钟,150 目的金属丝网过滤,1500 rpm 离心 10 分钟吸取上清液检测。
 
  粪便
 
  尽量采集干的粪便,粪便过稀会较难处理且降低检测的准确性。采集的重量应大于50mg,将粪便用PBS洗3次(最终粪便质量:PBS 体积=1:9),用超声粉碎(或捣碎)后于5000×g离心10分钟,取上清检测。
 
  唾液
 
  将样品收集于离心管后在-70 度冰冻 1 小时。在冰上融化样品后,2000×g 离 心 10 分钟,取上清检测。
 
  皮肤组织
 
  用匀浆机加冰的 PBS 研磨 20-50 mg 的皮肤组织使其充分溶解,离心 20 分 钟,10000 g/分钟,取上清检测。
 
  牛乳
 
  于4度,12000g/分钟离心30分钟,去除上层脂肪,以及下层沉淀,取中间层样本用于检测。
 
  脑脊液、肺泡灌洗液
 
  样本收集后于1000×g 离心20分钟,离心后收集上清,并将标本保存于-20度,且应避免反复冻融。
 
  处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程,由于蛋白容易变性,降解,故 该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要,尤其注意不要反复冻融, 样本处理之后可分装密封保存,4 度保存应小于1周,-20 度不应超过1个月,-80 度不应超过2个月。
 
  在标本使用前应缓慢均衡至室温,不应加热使之融解。样本的处理是实验成功的第一步,以上就是关于Elisa特殊样本处。
 
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