测定步骤：

1、 酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。

2、 试剂三的稀释：将试剂三用蒸馏水稀释50倍，用多少配多少。（试剂三和蒸馏水1：49稀释。

3、 工作液配制：在试剂一加入100μl试剂二，充分混匀。配好的试剂4℃避光可保存一周。（若一次性测定样本较少，可按照实际用量将试剂一和试剂二按照20ml：0.1ml的比例混匀配制）

4、 将一瓶试剂四用5ml蒸馏水溶解（溶解后一周内用完）。

5、 样本测定（在96孔板中依次加入下列试剂）

特别提醒：本产品仅供科研研究使用，不得用于人体临床直接检测。

商品介绍：

选择抗凝的注意点：

①、每一份样本所加的抗凝剂的量要一致，同时所取的全血的量也要尽量一致;

②、收集抗凝全血后一定要轻轻颠倒，充分抗凝，防止部分血液未接触到抗凝剂而导致凝固;

③、抗凝全血收集的血浆相对较多（1ml抗凝全血能分离出0.4～0.5ml血浆）;

④、抗凝收集的血浆冷冻保存后，解冻时可能会出现絮状浑浊，如有则需要离心去掉浑浊后用于测定。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.        加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.        弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。

3.        温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.        每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.        温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.       依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.       用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

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