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细胞膜绿色荧光探针(DiO)
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细胞膜绿色荧光探针(DiO)公司正在出售的产品:15.6-1000 pg/mL ELISA Kit for Human Calponin-1 3.12-200 pmol/L ELISA Kit for Human Proinsulin 0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human Heat shock protein beta-6 0.156-10 ng/mL ELISA
  细胞膜绿色荧光探针(DiO)的详细资料:

操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔,通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100微升5000~10000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0~10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小时,使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度(如无570nm 滤光片,可以使用560-600nm 的滤光片)。

8、结果分析

a、细胞的存活率:将各测试孔的OD 值减去本底OD 值(完全培养基加MTT,无细胞)或空白药物孔OD 值(完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT,无细胞),各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示,T 为加药细胞的OD 值,C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =(加药细胞OD/对照细胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)

中文名称:细胞膜绿色荧光探针(DiO)

英文名称:DiOC18(3)

产品规格:10mg

产品货号:BJ-01X6572

本探针是常用的细胞膜荧光探针之一,呈现绿色荧光。DiO是一种亲脂性膜染料,进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱,仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiO被激发后可以发出绿色的荧光,DiO和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考下图。其中,大激发波长为484nm,大发射波长为501nm。

CAS:34215-57-1

分子式:C53H85ClN2O6

分子量:881.72

DiO可以溶解于无水乙醇、DMSO和DMF,溶解度约为1-2.5mg/ml。发现较难溶解时可以适当加热,并用超声处理以促进溶解。

DiO被广泛用于正向或逆向的,活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-term tracer)。DiO通常不会明显影响细胞的生存力(viability)。DiO对于细胞膜染色的荧光强度通常要低于DiI,有时对于某些经过固定的组织的染色效果欠佳。

DiO除了简单的细胞膜荧光标记外,还可以用于检测细胞的融合和粘附,检测发育或移植过程中细胞迁移,通过FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散,检测细胞毒性和标记脂蛋白等。

用于细胞膜荧光标记时,DiO的常用浓度为1-30μM,常用的浓度为5-10μM。DiO可以直接染色活的细胞或组织,染色时间通常为5-20分钟。对于固定的细胞或组织,通常宜使用配制在PBS中的4%多聚进行固定,使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。

注意事项:荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。

储存条件:4℃避光,有效期一年。

细胞培养操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备F-12K培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 细胞处理:

1) 复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。


2.png

细胞培养方法:

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

⑥悬浮细胞直接离心收集,细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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