特点: 1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。 2. 根据豹源性成分保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。 3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。 4. 一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。 5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。 6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。 储存条件:-20℃以下,有效期12个月。 产品名称 | 豹源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | | 货号 | BJ-R7380 |
使用方法: 一、样品采集: 1、食品样品:样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照菌检验要求进行。 2、血液样品:用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL,注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管,立即混匀。 3、粪便样品:取粪便置于灭菌的收集管中送检。 4、病灶部位样品:取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。 一、稀释 PCR 阳性对照(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例) 1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。 2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。 3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液(用带芯枪头,下同)。 4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。 5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用 6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。 7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
原理: 所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法: 在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图 2.TaqMan探针法: 探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成*同步。 邻三酚红英文名称:The adjacent benzene three phenol red分子式:400.36分子量: C19H12O8S:32638-88-3 5--1-(β-羟乙)吡唑分子式:127.14英文名称:5- amino -1- (2-hydroxyethyl) pyrazole:73616-27-0分子量: C5H9N3O 2-氟三氟甲氧分子式:180.1英文名称:2- f three f:2106-18-5分子量: C7H4F4O 3--5-羟吡分子式:110.11英文名称:3- amino -5- hydroxy pyridine:600103分子量: C5H6N2O 3,6-二溴咔唑分子式:325英文名称:3,6- dibromo carbazole:6825-20-3分子量: C12H7Br2N 人参皂甙Rh2英文名称:Ginsenoside Rh2分子式:622.87268分子量:C36H62O8:78214-33-2 1-溴-2,4-二氟分子式:192.99英文名称:1- -2,4- two fluoro bromide:348-57-2分子量: C6H3BrF2 4-溴-3-氟三氟甲分子式:243英文名称:4- -3- three f:40161-54-4分子量: C7H3BrF4 4,4'-二甲氧八氟联分子式:358.19英文名称:4,4'- eight, two f:2200-71-7分子量: C14H6F8O2 氢氧钾分子式:56.11英文名称:Koh:1310-58-3分子量: KOH 醋可的松英文名称:Cortisone acetate分子式:402.47分子量: C23H30O6:18357 豹源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae树状假丝酵母 Candida arborea 辅肌动蛋白α3(ACTN3)重组蛋白英文名称:Recombinant Actinin Alpha 3 (ACTN3) 3% NaC1氨基酸脱羧酶对照发酵管BR20支国产/进口 HO-8910(人卵巢细胞)5×106cells/瓶×2 大豆慢生瘤菌 Bradyrhizobium japonicum无花果曲霉 Aspergillus ficuum 大鼠卵巢上皮细胞*培养基100mL M17琼脂/M17 Agar牛奶和制品中酸菌检测和分离培养250克国产/进口 NCI-H838(人非小细胞肺细胞)Hep 3B(人肝细胞) 胎儿真皮成纤维细胞*培养基EJ(人膀胱细胞) Caki-1(人肾透明细胞细胞)5×106cells/瓶×2 叙利亚仓鼠肾细胞英文名称:BHK-21 实验过程: 一、试剂准备 1. DNA模板 2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μl Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。 3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。 三、注意事项 1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。设立一个的PCR实验室。 2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。 3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 4.PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。 5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。 6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。 |