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PCR反应温度循环参数详解
点击次数:853 更新时间:2023-11-13

PCR反应温度循环参数详解:

  1.变性温度与时间

  PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有的模板DNA和PCR产物双链解开,才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高,时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性,所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要,需时间较长,因模板DNA的链比较长。

  2.复性温度与时间

  变性温度是PCR反应成败的关键,复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好,但是容易出现引物与靶DNA的错配,增加非特异性结合,温度太高不利于复性,大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后,复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。

  3.延伸温度与时间

  引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性,又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性,也会影响其产量,72℃时,核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S,这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而,延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增,延伸时间要长些。

  4.循环数:

  循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下,最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外,酶活性不好,或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。


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