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免疫荧光(IF)操作步骤
点击次数:248 更新时间:2024-09-18

操作步骤:
1、细胞准备:对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定:根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
3、通透:使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min。
4、封闭:使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min。
5、一抗结合:室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min。
6、二抗结合:间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
7、封片及检测:滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。


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