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重组菌的发酵及发酵条件的优化
点击次数:976 更新时间:2018-07-24

elisa酶联免疫试剂盒1.1.1 菌株与质粒
Escherichia coli DH5α 和 BL21 (DE3) 由本实验室保存。E. coli DH5α 为基因克隆,E. coli BL21 (DE3) 为发酵培养菌株。 pCOLADuet-1 购自 Novagen 公司,pTrcHis2B 购自 Invitrogen 公司。pTrc-low、pACYCDuet-mvaE-mvaS 为本实验已构建好质粒,其中 pTrc-low 是以 pTrcHis2B 为载体,携带了来源于酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 的 PMD、MK、PMK 和 IPI 四种酶的基因;pACYCDuet-mvaE-mvaS 是以 pACYCDuet-1 为载体,携带粪肠球菌 Enterococcus faecalis 的 mvaS 和 mvaE 两种酶的基因。基因 gpps、ls 和 p450 经过大肠杆菌表达宿主序列优化后,由金唯智公司合成,并连接到载体 pUC57 上。
1.1.2 培养基
LB 培养基:10.0 g/L 蛋白胨、5.0 g/L 酵母粉、 10.0 g/L NaCl,pH 7.0,用于大肠杆菌的培养。紫苏醇的发酵培养基是在 LB 培养基的基础上添加终浓度为 2 mmol/L 的 MgSO4。根据质粒抗性需要添加相应抗生素,培养基中抗生素终浓度为:Kan 50 μg/mL, Amp 100 μg/mL,抗生素购自北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3 试剂及仪器
基因组 DNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶纯化回收试剂盒和 DNA 纯化试剂盒购自 Omega 公司;PrimeSTAR Max DNA Polymerase 购自 TaKaRa 公司;限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自 Thermo scientific 公司;DNA Marker 等购自北京全式金生物技术有限公司;引物合成和基因测序是由青岛擎科生物技术公司负责完成。实验过程中使用的主要仪器包括:Bio-Rad PCR 仪、 Bio-Rad 凝胶成像仪、Bio-Rad 电泳仪、Varian GC450 气相色谱、Varian Cary50 分光光度计。
1.2 基因克隆和质粒构建
质粒 DNA 提取、PCR 扩增、限制性酶切、连接等均按说明书和常规方法进行。本研究质粒构建相关引物见表 1。培养携带 pUC57-p450 和 pUC57-ls 的载体菌株,提取质粒。再分别以质粒 pACYCDuet-mvaE-mvaS 和 pUC57-gpps 为模板,采用 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 扩增基因 mvaE-mvaS、gpps。PCR 产物经过电泳分析后,回收 PCR 目的片段,将回收产物和质粒进行双酶切,酶切产物用 DNA 纯化试剂盒回收,再连接到经同样酶切并回收的质粒载体 pCOLADuet-1 上,获得重组质粒。感受态细胞采用 Competent Cell Preparation Kit 试剂盒 (TaKaRa 公司) 进行制备。
1.3 重组菌的发酵及发酵条件的优化
1.3.1 发酵条件的优化
诱导 OD 值对合成紫苏醇的影响:重组质粒 pCOLA-gpps-mva-ls-p450 和 pTrc-low 转化到 E. coli BL21 (DE3) 中获得合成紫苏醇的重组大肠杆菌。挑取平板上的单菌落,接种于 4 mL (加入适量的 Amp 和 Kan) 的 LB 培养基中,37 ℃、200 r/min 振荡培养 8 h。将 500 µL 上述种子液接种于 50 mL 发酵培养基 (含 Amp 和 Kan) 中,37 ℃、200 r/min 振荡培养。分别在菌液 OD600 达到 0.3、0.6、0.8、 1.0 和 1.5 时,加入诱导剂 IPTG 诱导,30 ℃诱导培养。发酵 36 h 后,检测紫苏醇的含量。

 

联系人:王经理
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