免疫印迹中免疫沉淀蛋白的制备
 
    1．对照   
    实验对照的设置应包括能与免疫抗体共沉淀的样品和能与非免疫抗体共沉淀的样品。通过两者比较可以鉴别免疫抗体所识别的条带和非特异性的背景条带(如来自重链的条带)。此外还应该包括含有已知的或标准量的待测抗原的阳性样品，阳性对照可以是含有已知或标准量待测抗原的任何样品，来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或来源于已充分鉴定的细胞系。该样品不必经过免疫沉淀但应在邻近的胶道和其他样品同时上样电泳。它可提示免疫印迹是否成功，并对抗原的相对分子质量进行比较。如果阳性对照中抗原的量是已知的，可粗略估计待测样品中抗原的含量。
 
    2．准备工作
准备1个70℃水浴箱。
 
    3．需要的溶液
    不含DTT的Laemmli样品缓冲液(20％SDS、10％甘油、60mmol／LTris，pH 6．8和0．01％溴酚蓝)；
    lmol／LDTT(—20C贮存)
 
    4．操作步骤
    (1)将样品缓冲液加入吸附抗原和抗体，并经过洗涤的A蛋白或G蛋白微珠中。使样品缓冲液和微珠的体积比率至少为2：1。5：1左右更好，但一般不超过10：1。
    Tris/GlycineSDS—PAGE样品应用缓冲液的条件是：2％SDS、100mmol／LDTT(取自—20T3存放的lmol／L贮存液，临用前加入)、60mmol／LTris(pH 6．8)、0．01％溴酚蓝和10％甘油。
    (2)样品置70C水浴加热至少5rain。除特殊情况外，在凝胶内加样之前不必去除微珠。
    至此，电泳样品已准备就绪。
样品既可立即使用也可冻存。—20C存放的样品可稳定保存数月。
 
    5．常见问题
    将免疫沉淀制备的蛋白用于免疫印迹时，来自免疫沉淀的抗体会出现在印迹膜上，该抗体可被二抗试剂检出。通常抗体重链和轻链的大小并不干扰待测抗原的鉴定。然而，若待测抗原的大小在50kDa或25kDa左右(大约为重链和轻链多肽的大小)，有两种解决办法。一是可将免疫沉淀抗体共价结合在A蛋白或G蛋白微珠上；其二是采用直接检测技术进行测定。