蛋白质纯化亲和层析法

    仪器设备：

    亲和层析管柱 (Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm)

    分划收集器 (另需准备干净试管约25 支)

    药品试剂：

    金属螯合亲和层析胶体 (Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210) 1 mL

    ◆ 在洋菜胶粒上接有nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。

    Buffer B-300/0 (50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl)

    ◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。

    Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole

    Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

    方法步骤：

    1) 亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，准备注入样本。

    2) 除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 (IEX) 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄亂胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 mL。

    3) 待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer B-300/20，打开出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL。

    4) 接着以buffer B-300/250 流洗30 mL，方法同上，收集各分划。

    5) 所有分划均定量蛋白质并测定酶活性，收集酶活性zui高的数个分划，共得 _______ mL (AF)，保留100 μL 以供分析。