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博湖试剂-ELISA试剂组成
点击次数:671 更新时间:2014-04-21

ELISA试剂组成
抗体  在ELISA中应用的抗体可分为多克隆抗体(多抗)和单克隆抗体(单抗)。多抗取白免疫动物的抗血清,制备较简单,但抗血清成分复杂,除含针对抗原(多个表位)的抗体外,还含有多种其他抗体,亲和力和特异性相对要低于单抗,且制备周期长,批间差异较大。而单抗仅针对抗体的单一表位,亲和力和特异性均较多抗高,且制备技术成熟,产量大,批间差异小,但结合位点的单一也正是其弱点之所在,在双抗体夹心法中,如包被和指示抗体使用同一单抗,则由于结合位点的缺乏,容易造成假阴.性结果。在使用双单抗一步法时,应注意抗原过剩时的“钩状效应"
 
    酶和底物  在ELISA中zui常用的酶为HRP和ALP。
    (1)HRP:是一种糖蛋白,含糖量约18%,分子量为44kD,在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素) 结合形成一种卟啉蛋白质。主酶为五色糖蛋白,在275nm波长处有zui高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环,是酶的活性基团,在403nm波长处有zui高吸收峰。HRP的纯度用纯度值(reinhartzahl,RZ)表示,RZ=A403nm/A275nm,即403nm的吸光度与280nm的吸光度之比,高纯度HRP的RZ值应≥3.0。HRP质量的另一重要指标是酶活力,以单位(unit,U)表示。用于标记的HRP比活性应≥250U/mg。HRP的作用底物为H202,催化下列反应;
DH2+H202  HRP  D+2H2O
   上式中DH2为供氢体(即底物),H2O2为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高,除H2O2外,仅作用于小分子醇和尿素的过氧化物。HRP的底物有多种,在ELISA中常用的有:邻苯二胺(orthophenylenediamine,OPD),四甲基联苯胺(3,3,5,5- tetramethyl-benzidine,TMB)和2,2,-连氮基-双-3-乙基苯噻唑啉磺酸盐[2,2,-azino-bisc(3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6),ABTS]。三者各有优缺点:OPD是在ELISA中应用zui多的底物,灵敏度高,比色方便,但配成溶液后稳定性差,且有致异变性;TMB经酶作用后由五色变蓝色,加酸终止反应后显黄色,目测对比鲜明,可比色定量,溶液的稳定性也较差,但无致异变性,因此应用日见增多;ABTS虽然灵敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。
    (2)ALP:是一种磷酸酯的水解酶,用做示踪酶的ALP活性应在l 000U/mg以上。ALP常用的底物为对硝基苯磷酸盐(PNP),降解产物为黄色的对硝基酚。经NaOH终止酶反应后,颜色维持比较稳定。
在ELISA中酶作用于底物后生成有色物质、荧光物质或导致化学发光,分别可用分光光度计、荧光光度计测量及照度计测量。荧光和化学发光测定的敏感度均高于比色测定,标准曲线的线性范围亦较比色反应宽,测定效果优于常用的比色ELISA。
 

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