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逆转录实验三大要素分析
点击次数:152 更新时间:2024-03-04

逆转录(reverse transcription)是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程,即 RNA 指导下的 DNA 合成。是某些病毒的复制形式,需逆转录酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。逆转录实验包括3大要素,分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板:


1. 引物:逆转录引物主要有3种,包括 Oligo(dT)、Random Primers 和基因特异性引物(GSP)。其中 Oligo(dT)具有12-20个 T 碱基,并且与真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配对,可合成全长的 cDNA,但仅扩增有 polyA 尾的 mRNA ,对模板质量要求高,较适合克隆实验。而 Random Primers 具有6-9个碱基,可随机识别模板并结合,适合复杂结构和微量模板,但特异性低,小片段多,适合后续 qPCR 实验。基因特异性引物可以识别特定模板序列,具有特异性强,灵敏度高的特点,但需合成特定的序列。所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。


2. 逆转录酶:一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV),由两条肽链组成,具有聚合酶活性和很强的 RNaseH 活性,它最适温度是42℃,最适 pH8.3,在高反应温度时可消除 mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍,然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。另一种来源于鼠白血病病毒(M-MLV),是单肽链的,有 RNA 聚合酶活性和相对较弱的 RNaseH 活性,最适温度37℃,最适 pH7.6,较弱的  RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。


3. RNA 模板:通常利用紫外分光光度计检测纯度,要求A260/280=1.9~2.1,A260/230=2.0~2.2。利用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整度,完整的总 RNA 在进行琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的28S 和18S rRNA 条带(真核样品),28S rRNA  条带的强度应当大致为18S rRNA 条带的两倍,并且无 gDNA 和蛋白残留。

 


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