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荧光定量PCR使用的荧光化学
点击次数:136 发布时间:2022-10-24

实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。其原理如下:

一、TaqMan荧光探针:
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成*同步。

二、SYBR荧光染料:
在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。
荧光染料也称DNA结合染料,目前主要使用的染料分子是SYBR Green I,SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合,游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号,但结合双链DNA后,其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加,PCR产物与染料的结合量也增大,其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。实验室常用的为SYBR Green I荧光染料。


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