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PCR步骤及循环参数
点击次数:736 发布时间:2021-10-08
  PCR步骤:1.  DNA变性
 
  (90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA。
 
  2.  退火
 
  (25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
 
  3.  延伸
 
  (70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链
 
  PCR的循环参数:
 
  1.  预变性(Initial denaturation)
 
  模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
 
  2.  循环中的变性步骤
 
  循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。
 
  3.  引物退火(Primer annealing)
 
  退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
 
  退火温度对PCR的特异性有较大影响。
 
  4.  引物延伸
 
  引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略
 
  延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。
 
  5.  循环数
 
  大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。
 
  6.  最后延伸
 
  在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。
 
  
 
联系人:王经理
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