设为主页
加入收藏
联系我们PCR步骤及循环参数
点击次数：3074 更新时间：2021-10-08
PCR步骤：1. DNA变性
(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。
2. 退火
(25℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3. 延伸
(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链
PCR的循环参数：
1. 预变性(Initial denaturation)
模板DNA*变性与PCR酶的*激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列*变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不*，易造成扩增失败。
3. 引物退火(Primer annealing)
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。
5. 循环数
大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸*，并使单链产物退火成双链。
