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ELISA实验样本处理方法
点击次数:133 发布时间:2021-06-09

ELISA实验样本处理方法

常规用于ELISA实验的样本包含血清、血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异,合适的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里,我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。

1. 血清

血清是ELISA实验经常用的样本,其预处理也十分简单。

使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本,将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜,分离出血清(建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面,使血清可以更大程度地分离出来)。2-8℃下以1000×g离心20分钟,小心收集上清液(血清),立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融。

在收集血液样本的过程中应避免溶血,因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质,这种情况下,ELISA实验中将会出现非特异性显色反应,导致检测结果不准确。另外,样本还应避免细菌污染,因为细菌可能含有内源性HRP,也会导致检测结果不准确。

2. 血浆

使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本,采集后30分钟内,2-8℃下以1000×g离心15分钟,小心收集上清液(血浆)。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存,避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括EDTA钠盐,肝素钠,枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书,查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

3. 细胞培养上清

将细胞培养上清液吸入离心管中,在2-8℃下以1000×g离心20分钟,除去细胞碎片和杂质,收集上清液备用,样本保存在-20℃或-80℃,避免反复冻融。

4.   细胞提取液

反复冻融方法

1) 吸出培养板中的培养基,用胰蛋白酶消化细胞,然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。

2) 将细胞悬浮液收集到离心管中,在2-8℃下以1000×g离心5分钟,然后吸去培养基,用预冷PBS洗涤细胞3次。

3) 加入适量的预冷PBS(建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞。在6孔培养板(约1×106个细胞)中,每个孔加入150-250μL的PBS来重悬细胞。

4) 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融,重复冻融过程数次,直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

5) 2-8℃下以1500×g离心10分钟,去除细胞碎片,收集上清液,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

5. 组织匀浆

1) 用预冷的PBS(0.01M,PH7.4)冲洗组织以除去表面残留的血液或杂质(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)。

2) 将组织块称重,然后切成尽可能小的碎块,以便充分匀浆。

3) 加入适量的预冷PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂),用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。

4) 将匀浆液吸入离心管中,2-8℃下以5000×g离心5分钟,收集上清液,保存至-20℃或-80℃,避免反复冻融。

6. 唾液

在2-8℃下,4000×g离心10分钟以去除杂质,取上清即可检测。建议使用新鲜的唾液样本检测。

7. 尿液

使用无菌容器收集尿液样本。在2-8℃下,1000×g离心15分钟以去除杂质,取上清即可检测。

8.   粪便

将粪便样本用PBS(0.01M, pH=7.4)重悬,置于冰上振荡15分钟,然后在2-8℃,5000×g离心5分钟,取上清即可检测。

9. 其他生物体液

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