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影响PCR反应的因素到底有哪些
点击次数:173 发布时间:2019-12-27
  无论是进行cDNA合成还是进行PCR扩增,均可通过方便的一步法方案进行。我们的一步法RT-PCR试剂盒含有dNTP及反转录酶和热稳定性热启动DNA聚合酶的混合物,三者存在于佳的反应缓冲液中。只需加入您的RNA样品及基因特异性引物,即可开始您的反应.
 
  PCR反应的影响因素
 
  变性温度与时间:模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃ 20~30秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热DNA聚合酶的活力,zui高变性温度不宜超过95℃。
 
  退火温度与时间:退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的zui适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃,退火时间一般为30~60秒,足以使引物与模板之间完全结合,长时间退火没有必要。
 
  延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增2 Kb片段,若使用Taq酶只需1分钟,使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现,时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
 
  PCR试剂盒循环次数:可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设定20-40个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。
 
  酶量:50 μL反应体系可用0.5-5 U酶,酶量的选择与模板DNA的量,扩增片段大小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。
 
  模板:模板可以是单链DNA,也可以是双链DNA,质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多,不超过1 μg为宜,因为加量过多可能导致非特异性扩增增加,但是要考虑模板中靶序列的含量。例如,使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列,就需要适当加大模板用量。
 
  ?引物:引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,zui高不宜超过30个核苷酸,zui佳长度为20~24个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5’端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构,如发夹结构。两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3’端。如果可能,引物3’端zui好富有GC,这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物zui好经过色谱层析纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 μM左右,浓度太高会导致非特异性扩增,太低则扩增产物太少。
联系人:王经理
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