1.断定抗生素效果的浓度: 不一样的细胞株对各种抗生素有不一样的敏感性,因而在选择前要做预实验,断定抗生素对所选择细胞的zui低效果浓度。ELISA试剂盒
① 提早 24 小时在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔,接种量以第二天长成 25%单层为宜,置 CO2 孵箱中 37℃培育过夜。
② 将培育液换成含抗生素的培育基, 抗生素浓度按梯度递加0,(50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml)。
③ 培育 10-14 天以绝大部分细胞浓度为准,通常为 400-800μg/ml,选择稳 定表达克隆时可比该浓度恰当提高一个等级维持时运用选择浓度的一半。
2.转染按前面的过程进行。
3.转染 72 小时后按 1: 10 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代,换为含预实验中 断定的抗生素浓度的选择培育基。在6 孔板内可见单个细胞,持续培育可见单个 细胞分裂繁衍构成单个抗性集落,此刻可用两种办法选择单克隆。
① 滤纸片法:用消毒的 5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上 10-15 秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中持续加压培育。 细胞在 24 孔板中长满后转入 25cm2 培育瓶中,长满后再转入 75cm2 培育瓶中培育。
② 有限稀释法:将细胞消化下来后做接连的 10 倍稀释(10-2-10-10) ,将每 一稀释度的细胞滴加到 96 孔板中培育,7- 10 天后,选择单个克隆成长的孔再一次进行克隆。
4. ELISA或 Westernblot检查单克隆细胞中外源蛋白的表达状况因为不一样克隆的 表达水平存在区别因而可一起选择多个克隆选择表达量zui高的克隆传代并保种。
CACNB4 L型电压依赖型钙通道β4抗体
CACNA1G + CACNA1H 电压依赖性钙通道CACNA1G+CACNA1H抗体
CABP1 钙结合蛋白1抗体
CAPON 神经型一氧化氮合成酶结合蛋白抗体
CHRM4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M4抗体
CaMK2 alpha 钙/钙调素依赖蛋白激酶2α抗体
CACYBP 周期蛋白结合蛋白抗体
CDCA2 细胞分裂周期蛋白2抗体
CDC45L 细胞分裂周期调控蛋白45抗体
CAPH 染色体相关蛋白H抗体
CEP76 中心体蛋白质76抗体